紅汁乳菇液體發酵培養基優化*

周偉堅，查麗燕，王 越，張振偉，文華樞，莫美華

（華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642）

紅汁乳菇（Lactarius hatsudake）屬擔子菌門（Basidiomycota）傘菌目（Agaricales）紅菇科（Russulaceae）乳菇屬（Lactarius），是一種松樹（Pinus）、柏樹（Platycladus orientalis)、杉樹（Taxodiaceae）等樹種的菌根菌，常于春末夏初和秋末冬初散生于馬尾松（Pinus massoniana Lamb.）林地上[1-2]。紅汁乳菇在我國分布廣泛，北至吉林、河北，南至福建、臺灣、廣東，西至廣西、云南、四川、貴州、西藏等地都有分布[3]。紅汁乳菇因其菌肉肥厚、香氣濃郁、口感甚佳、質脆味美、營養豐富，是人們最喜歡的野生食用菌之一[4-6]。同時，紅汁乳菇具有很高的食（藥）用價值和經濟價值，既有防癌抗癌的功效[7]，又可用作生態工程營林、橡膠生產的原材料，并能調節植物生長等[8]，所以紅汁乳菇在各地銷售市場上十分走俏。然而就像其他菌根菌一樣，紅汁乳菇目前尚不能人工栽培，在自然條件下產量較低，難以形成大批量生產，市場供應依賴于野外采集，在湖南、廣西一帶市場價格可達120元/kg～180元/kg。由于大量采集，加之自然生態條件惡化，野生紅汁乳菇數量日益減少，價格增長，繼而導致人們掠奪式的采收。譚著明等[9]通過人工合成菌根，實現了紅汁乳菇的半人工栽培，可以提高紅汁乳菇的產量，但是仍需要依賴適宜的自然條件才能起到增產效果。因此，為合理開發紅汁乳菇的資源并滿足市場需求，必須研究其適宜生長的條件，優化其發酵培養基配方，為人工培養提供理論基礎。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌種

紅汁乳菇菌種由華南農業大學食品學院莫美華教授提供，菌種采自廣西桂林，分離保存。

1.1.2 試驗藥品

酵母膏、蛋白胨，廣東環凱微生物科技有限公司；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、蔗糖、葡萄糖、硫酸銨，廣州化學試劑廠，分析純；石膏、石灰、玉米粉、棉籽殼、麩皮、豆粕粉，市售。

1.1.3 培養基的配方

完全培養基：蛋白胨2.0 g、酵母膏2.0 g，葡萄糖20 g、瓊脂20 g，磷酸氫二鉀1.00 g、硫酸鎂0.50 g、磷酸二氫鉀0.46 g，水1 000 mL，pH自然。

液體完全培養基：蛋白胨2.0 g、酵母膏2.0 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀1.00 g、硫酸鎂0.50 g、磷酸二氫鉀0.46 g，水1 000 mL，pH自然。

1.1.4 儀器與設備

手提式壓力蒸汽滅菌鍋YX-280，北京中西集團；微波爐WG800SL23-K6，格蘭仕集團；數顯電熱鼓風干燥箱101AS-3，東莞市吉之壟電子儀器廠；電磁爐MC-EP201，美的集團；生化培養箱LRH-250-Ⅱ，河南兄弟儀器設備有限公司；電子天平PL602-S，上海滬沁儀器設備有限公司；超凈工作臺SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術有限公司；搖床HZQ-QG，北京東聯哈爾儀器制造有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 均勻設計法

發酵培養基的優化采用均勻設計的方法進行[10]。通過前人的試驗以及查找資料[11-12]發現，石膏、石灰、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、玉米粉、蔗糖、棉籽殼、蛋白胨、麩皮、豆粕粉在珍稀食用菌的菌絲培養中起著重要作用，因此選擇這10種物質作為參試因子，水平因素見表1。將各因素的水平值按所在列的編號分別對號填入，均勻設計表見表2。

由表1、表2可知，以資料中10種參試因子的常用量作為中點，每一因子設計出12個水平，選用U12（1210）均勻設計表安排試驗。

1.2.2 培養基制備

分別把石膏、石灰、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、玉米粉、蔗糖、棉籽殼、酵母膏、麩皮、豆粕粉水煮20 min，濾布過濾，將濾液濃縮成各個水平所需濃度，配制培養基。每個水平配500 mL，平均分裝于5個三角瓶中，設5個重復，每瓶裝液量為100 mL。裝液后瓶口塞上棉塞，外包牛皮紙，用高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌30 min，冷卻，待用。

取活化好的紅汁乳菇菌種，用經滅菌的打孔器打成1.0 cm圓片，分別將若干片菌絲塊打碎并接入三角瓶中，塞好棉塞，置于25℃、170 r·min-1的搖床中培養，培養時間為10 d。培養期間，定期對菌絲生長情況進行觀察記錄。

1.2.3 菌絲體生物量的測定

培養結束后將發酵液分別裝于100 mL的離心管中，除去多余培養液，加入50 mL～80 mL無菌蒸餾水，6 000 r·min-1離心10 min，除去多余水分；加入無菌蒸餾水洗滌6次，直至粘附在菌絲上的液體培養基被清洗干凈，用吸水紙吸干水分，待表面沒有游離水時，測量菌絲體濕重。再將菌絲體轉移到干凈平皿中，并在平皿中墊1層保鮮膜，以便獲取干燥菌絲，50℃真空干燥至恒重，電子天平準確稱重，計算各處理平均值；以此結果作為各處理的目標函數，經DPS v8.01軟件對試驗數據進行回歸分析。

1.2.4 對比驗證試驗設計

將理論最優配方與均勻設計試驗中的直觀最優配方進行對比驗證試驗；另外，也將理論最優配方、直觀最優配方和完全培養基進行了對比驗證試驗。

2 結果與分析

2.1 以干重為目標函數的優化結果

2.1.1 均勻設計試驗結果的回歸分析

以干重為目標函數（y）對數據進行統計分析，所得結果見表3。

表3 均勻設計試驗結果Tab.3 Uniform design test results

如表3所示，建立以干重（y，g·100-1mL-1）為目標函數的二次回歸方程為：

式中：x2為蔗糖水平（g·100-1mL-1）；x3為棉籽殼水平（g·100-1mL-1）；x4為蛋白胨水平（g·100-1mL-1）；x5為麩皮水平（g·100-1mL-1）；x7為石膏水平（g·100-1mL-1）；x8為石灰水平（g·100-1mL-1）；x9為磷酸二氫鉀水平（g·100-1mL-1）；x10為磷酸氫二鉀水平（g·100-1mL-1）。

對回歸方程進行檢驗，最終得出相關系數R=0.999 9，F值=2 720.871 1，顯著水平P=0.000 4，剩余標準差SSE=0.004 0。回歸方程顯著水平P=0.000 4＜0.010 0，即能達到0.01的極顯著水平，調整后Ra=0.999 8，說明方程的可信度較好。

2.1.2 回歸項的回歸系數的t檢驗結果

各項試驗因子回歸系數和t檢驗結果見表4。

表4 各項回歸項的回歸系數檢驗結果Tab.4 Test results of regression coefficient of each regression term

由表4可知，方程中各回歸項的顯著水平均小于0.01，這說明方程中引入的各項對菌絲體干重均有很大影響，全部達到極顯著水平。

2.1.3 觀察值和擬合值

回歸方程的觀測值與擬合值見表5。

表5 樣本的觀察值、擬合值和擬合誤差Tab.5 Observation value,fitting value and fitting error of samples

由表5可知，觀測值與擬合值很相近，最大擬合誤差絕對值為0.003 0，進一步說明了回歸方程的準確性。通過數學模擬分析，找出一個理論最優的紅汁乳菇菌絲培養基配方（1 L）為：玉米10.91 g、蔗糖3.65 g、棉籽殼 41.24g、蛋白胨0.01 g、麩皮26.22 g、豆粕粉4.35 g、石膏1.25 g、石灰0.13 g。

2.2 優化配方驗證試驗

由上述的均勻設計試驗結果表3可以看出干重較大的直觀最優配方是配方12，將理論最優配方、直觀最優配方12與完全培養基進行對比驗證試驗，試驗方案如表6。

表6 驗證試驗方案Tab.6 Verification test scheme

如表6所示，培養基均加水1 000 mL，pH自然。接種量統一為1片直徑為1.0 cm的紅汁乳菇菌絲塊，發酵周期10 d，重復3次，比較不同培養基配方對紅汁乳菇菌絲生物量的影響。完全培養基配方為：蛋白胨2 g、酵母膏2 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，磷酸氫二鉀1.00 g、硫酸鎂0.50 g、磷酸二氫鉀0.46 g。

2.3 優化配方驗證試驗結果

對比驗證試驗數據分析結果見表7。

如表7所示，分別得出理論最優配方組、直觀最優配方12組和完全培養基組的干重、濕重。利用Duncan新復極差檢驗可看出理論最優配方平均濕重和干重均顯著高于配方12和完全培養基的濕重和干重（P＜0.05），這說明所篩選的最優配方更適合紅汁乳菇菌絲生長。

表7 優化配方驗證試驗結果Tab.7 Validation test results of optimized formula

驗證試驗結果紅汁乳菇液體培養情況見圖1、圖2。

由圖1可知，利用優化配方發酵的菌球大、數量多、產量高，且形成了紅色小菇蕾；配方12發酵的菌球數量較少，也有少量紅色菇蕾形成；完全培養基發酵的菌球較小，顏色較白，未形成紅色小菇蕾。由圖2可知，利用該優化配方發酵紅汁乳菇菌絲還出現了小菇蕾，這對尚不能實現人工栽培的菌根菌紅汁乳菇的進一步馴化栽培具有一定指導意義。

3 結論與討論

通過均勻設計法篩選出最佳紅汁乳菇液體培養基優化配方，即1 L培養基中各成分用量為：玉米10.91 g、蔗糖3.65 g、棉籽殼 41.24 g、蛋白胨0.01 g、麩皮26.22 g、豆粕粉4.35 g、石膏1.25 g、石灰0.13 g。利用該優化配方配制的培養基，在25℃、170 r·min-1下發酵紅汁乳菇菌絲10 d可得菌絲平均干重 17.89 g·L-1，平均濕重 83.12 g·L-1，顯著高于完全培養基和直觀優化配方12。這一結果遠高于前人的研究[13-17]。在發酵液中出現了小菇蕾，這對于菌根菌紅汁乳菇的馴化栽培具有一定指導意義。