食用菌活性成分綠色提取方法研究進展*

喻文麗 ，樊永紅 **，迪拉熱·海米提 ，艾海白爾·卡斯木

（1.新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆干旱區生物資源保護與利用實驗室，新疆 烏魯木齊 830046）

全世界至少分布著15 000種大型真菌，有超過2 000種大型真菌被證實可以食用[1]。中國、美國、荷蘭、意大利、波蘭是世界上栽培、消費食用菌較多的國家。食用菌含有豐富的營養物質，如蛋白質、粗纖維和必需氨基酸等[2]；同時含有大量活性物質，如多糖、黃酮類、萜類、生物堿等[3]。食用菌可以廣泛的應用于藥物合成，也可作為功能性食品[4]。對于活性成分的提取，常采用溶劑萃取法將食用菌的有效成分萃取出來，主要是借助大量溶劑（一般為水或有機溶劑）將目標成分溶解。操作簡單，溶劑易獲取，但是對環境污染較大、提取率低、成本高，耗時長[5]。因此近些年國內外出現了許多高效、綠色的提取方法，可替代溶劑萃取法。通過對提取食用菌活性成分的綠色方法進行綜述，以對提取方法的發展趨勢進行展望。

1 綠色提取方法

1.1 超聲波輔助萃取法

超聲波輔助提取法主要借助超聲波在液體中產生的空化效應、熱效應和機械效應，破壞食用菌細胞壁，增加了傳質過程，加速反應速率[6]。廣泛使用的是酶協同超聲波提取法。超聲輔助萃取法相比一般提取方法，可克服傳統方法的用時長、溶劑用量多的局限性；提取溫度低，能完整的保持活性成分；并且工藝耗能低、產量高[7]。

超聲波輔助提取法已經被許多研究者廣泛應用。利用酶協同超聲波方法，在超聲功率為340 W，固液比為1∶30，超聲時間14 min條件下，香菇多糖得率為14.39%，明顯高于水提法的香菇多糖得率[8]。超聲波探針的探入增加了固液之間的傳質和有效接觸面。研究表明，超聲波輔助法相比水提法能更有效地從金針菇中提取多糖，并且前者提取的金針菇多糖的抗氧化性更強[9]。超聲輔助提取多糖的裝置示意圖見圖1[10]。

另一項研究中，研究了從黑木耳（Auricularia heimuer）中提取多糖的最佳超聲波輔助提取條件，發現超聲處理功率為350 W，固液比為1∶5，提取時間35 min，提取溫度90℃，多糖得率最高。此外，研究了雙孢菇（Agaricus bisporus）中提取多糖的最佳參數，結果顯示超聲處理功率230 W，提取時間62 min，提取溫度70℃，多糖得率最高可達6.02%，且提取的多糖具有良好的抗氧化活性，如在濃度為250 μg·mL-1時，雙孢菇多糖與對照相比具有更高的自由基清除活性[11]。靈芝在不同提取處理下的電鏡細胞結構[12]見圖2。

由圖2所示，圖A是靈芝未經任何處理下的電鏡圖，細胞壁與內容物的結構都非常完整、緊實。圖B和圖D是經過索氏提取和熱水提取的靈芝電鏡圖，其結構有輕微改變。圖C是經過超聲波處理后的靈芝電鏡圖，細胞基質已經完全改變，結構發生了劇烈變化[13]。超聲波輔助提取法通過破壞靈芝等食用菌的組織結構，提高活性成分的傳質率，增加了活性成分的提取率。

1.2 超高壓輔助萃取法

超高壓輔助萃取法是近些年發展較快的一種新型技術，可用于提高食用菌中活性成分的提取率，一方面高壓可迅速破壞細胞結構，另一方面可加快傳質[13]。萃取溶劑在超高壓下迅速滲透到食用菌細胞中，造成細胞體積變化，打破化學平衡，促進細胞移動。在幾秒鐘內完成減壓，細胞的壓力從高壓迅速降到大氣壓，在反方向壓力作用下，細胞壁和細胞膜受到強烈的沖擊變形，壓力越大，細胞的滲透性越強。活性成分的溶解度隨著壓力的增加而增大，隨著越多的萃取溶劑進入細胞，溶解在細胞內的活性成分在高滲透壓下迅速轉移到細胞外實現高效提取。超高壓輔助萃取主要由高壓系統和樣本腔組成[14]，原理見圖3。

由圖3所示，超高壓輔助萃取法處理食用菌的溫度一般較低，可以提取不耐熱的活性成分，效率高，能耗低。超高壓輔助萃取法可有效破壞細胞結構，減少傳質阻力，香菇（Lentinus edodes）子實體通過一般破碎均質法（對照）和超高壓輔助萃取法試驗提取香菇多糖。不同提取方法香菇細胞結構電鏡圖見圖4。

由圖4可知，對照組的細胞結構有一定的損傷，但是細胞結構未被完全破壞，有較大顆粒存在，而試驗組中已觀察不到大顆粒，同時很難觀察到細胞結構，細胞破碎的較徹底[15]。研究發現，蛹蟲草（Cordyceps militaris）多糖采用超高壓萃取法后，多糖率可顯著提高，當壓力為424 MPa，保壓時間5.18 min，提取溫度為43.5℃時，蛹蟲草多糖得率可達到14.89%[16]。當提取時間為4 min，壓力為350 MPa，料液比為1∶35，提取溫度為55℃的條件下，香菇多糖提取率為8.96%，此法比水提法和超聲波酶解法的提取率都高[17]。

1.3 超臨界流體萃取法

超臨界流體是高于其溫度和壓力臨界點的物質，不存在明顯的液相和氣相。超臨界流體萃取法的基本特征是隨著流體壓力和溫度的改變，其密度即會改變，一些流體性質在氣體性質和液體性質之間。因超臨界流體的性質，更有利于提取細胞內化合物[18]。超臨界流體萃取法是借助超臨界流體介于2種狀態之間的性質，從固體和液體中獲得活性成分的現代技術，可高效地將目標成分從多種液體、固體或者混合物中提取。傳統的溶劑萃取是溶劑擴散到食用菌組織中，通過萃取溶劑將有效成分溶解出來。而超臨界流體在萃取時與材料之間不存在表面張力且粘度低于液體，因此流體擴散起來更快，萃取效率更高。對于相同的萃取過程，有機溶劑萃取需要幾個小時，而超臨界流體萃取法只需10 min～60 min[19]。超臨界流體萃取裝置[20]見圖5。

由圖5可知，超臨界流體萃取裝置包括二氧化碳泵、改性泵、萃取池、分流池和閥門。在操作中，流體（通常是二氧化碳）被加熱到超臨界狀態，然后迅速擴散到物料內部，溶解萃取容器中的目標活性成分。溶解的活性成分在低壓分離器中被分離出來，萃取后的超臨界流體可以被冷卻，再壓縮和回收或排放到大氣中。乙烷、丁烷、戊烷、一氧化二氮、氨、三氟甲烷和水都可用作超臨界流體，但二氧化碳常作為在提取有效成分時的超臨界流體。因為二氧化碳是一種不活潑的氣體，易制取、價格低、萃取過程不發生化學反應且提取的有效成分純度更高。該方法可在室溫下操作，防止熱敏物質的氧化及逸散。二氧化碳僅使用于萃取非極性化合物，萃取極性分子時必須向超臨界流體中加入乙醇或甲醇等極性溶劑，萃取成功的關鍵在于極性溶劑的選擇。研究表明提取香菇活性成分時，以乙醇為輔助溶劑和純二氧化碳為萃取劑的超臨界流體萃取得率分別為3.81%和1.01%，且只有超臨界流體提取物對黃體微球菌和蠟樣芽孢桿菌有抗菌活性[21]。研究發現聯合采用水提法、超臨界二氧化碳萃取法和熱水浸提法可從香菇中提取到麥角甾醇和其他類脂分子[22]。

1.4 微波輔助提取法

微波輔助提取法是一種快速、高效的提取方法，借助微波的均勻輻射加熱溶劑和樣品，促進目標組分的提取。微波是波長位于1 mm～1 m區間，頻率在300 MHz～300 GHz之間的非電離電磁波，在電磁波譜中位于X射線和紅外線之間[23]。傳統的熱萃取法是將能量通過熱傳導和熱輻射的方式，以無選擇、無規則的方式傳遞給萃取劑，萃取劑再將能量傳遞給基體物質，從基體中得到有效成分，因此萃取效率較低。而微波可以滲透到食用菌組織中，并與極性成分相互作用產生熱量。微波能的加熱通過離子傳導和偶極子旋轉直接作用于分子，由于動能增加以及離子的連續運動和方向變化而引起離子之間的摩擦，使離子產生熱效應。此過程中氫鍵遭到破壞，溶劑能更有效地滲透到食用菌基質中。此外，基于不同的介電常數，微波可選擇性地加熱目標組分[24]。樣品的介電常數和介電損耗決定了微波的加熱效應，所含組分的微波吸收特性主導了不同物質的微波吸收能力。較高的輻射功率能夠提高樣品和萃取溶劑混合溫度，增加加熱效應。因此，可通過控制微波輻射頻率提高萃取效率，或通過控制微波輻射功率萃取某一特定組分。此方法具有提取時間短、溶劑用量少、耗能低、工藝簡單、無污染等優點。微波輔助萃取裝置[25]見圖6。

有研究發現，用微波提取食用菌的DNA進行后續的PCR擴增時，只需少量的原始材料，并且幾分鐘就可完成，而傳統的方法需要大量工作，較多原始材料，數小時才能夠完成，且在擴增過程中需要用到昂貴且污染環境的化學物質用于細胞裂解和DNA純化，且微波輔助提取技術可靠性高（90%），適用于新鮮或陳化的真菌培養菌絲體[26]。微波輔助提取方法還可從雙孢菇中分離麥角甾醇，此法與傳統溶劑提取法相當，但是更簡單、快速、高效、經濟[27]。

大量研究表明，應用微波輔助提取法從食用菌中提取活性成分的得率與純度都較高[28]。通過正交優化后確定在微波時間4 min，功率640 W，液比1∶30，浸提2 h的條件下，雙孢菇多糖提取率能達到4.11%[29]。微波功率744.8W，微波時間4.2 min，料液比為1.0∶31.1時，蛹蟲草多糖得率可達到最高[30]。

為了更有效地在低溫高壓下萃取材料的活性成分，開發了“超聲-微波”協同萃取的方法，將2種方法的優勢充分結合。超聲波和微波可破壞細胞壁結構，使溶劑快速進入細胞，有效縮短萃取時間，提高萃取率。此外，該工藝有利于提取極性差、熱穩定性差的組分，避免了在高溫高壓下長時間提取而引起的分解，使萃取物的分子結構不被破壞。以靈芝為原料提取多糖，超聲功率50 W，微波功率284 W，提取時間701 s，料液比1.0∶11.6是最佳提取條件，此方法與傳統的熱水提取法相比，多糖的得率明顯提高，接近100%，比超聲輔助提取法提高了27.7%[31]。

1.5 高壓脈沖電場輔助萃取法

近幾年，高壓脈沖電場已被證實是食用菌提取活性物質很有前景的非熱處理提取技術，利用細胞膜電穿孔原理，短時間內對細胞壁和細胞膜造成破壞，致使細胞破壁[32]。典型的脈沖電場系統[20]見圖7。

由圖7可知，高壓脈沖電場輔助萃取裝置主要由脈沖發生器、處理室和處理產品的泵送系統組成，由示波器和計算機控制并監控。材料的理化性質和提取條件決定了高壓脈沖電場輔助提取的效果，而材料的理化性質主要是類型和細胞大小決定，提取條件一般是溫度、pH、電導率和粘度的選擇。在萃取的過程中，電場強度、脈沖寬度、處理時間直接影響萃取效果，而脈沖數和能量密度會間接影響萃取效果[33]。

高壓脈沖電場技術已經廣泛地用于從食用菌中提取活性化合物，從樺褐孔菌中提取多糖時，采用最佳的高壓脈沖電場條件，場強為30 kV·cm-1、脈沖數為6、料液比為1∶25、pH 10，多糖的提取率達49.8%，是熱堿提取的1.67倍，萃取時間短，萃取效率高且萃取物中的雜質較少[34]。高壓脈沖電場技術能顯著提高西藏靈芝的胞外多糖（EPS）提取率，在脈沖數為8，電場強度為40 kV·cm-1和pH為7的條件下，EPS的提取率提高了84.3%[35]。從木耳中提取真菌多糖，采用了高壓脈沖電場，超聲和微波輔助方法，優化提取條件，發現高壓脈沖電場的提取率最高[36]。高壓脈沖電場技術是一種有效的提取方法，通過控制高壓脈沖電場技術的處理條件，可以提高活性成分在不同材料中的溶解速度，提取率高，室溫下提取天然活性成分，分子結構不易被破壞。

2 綠色方法的前景和局限

大量的研究結果表明，超聲波輔助萃取法、超高壓輔助萃取法、超臨界流體萃取法、微波輔助萃取法以及高壓脈沖電場輔助萃取法都可快速、有效地萃取出食用菌中的活性成分，這些方法與傳統方法相比具有一定的優勢，但是各種方法也存在不足。各種方法的特點見表1。

表1 食用菌活性成分的提取方法比較Tab.1 Comparison of extraction methods of active components from edible fungi

由表1所示，不同食用菌活性成分相較傳統提取法有5個特點。

1）超聲波輔助萃取法與傳統萃取法相比，幾乎不污染環境，此方法可以單獨使用也可以與其他方法協同使用；不足之處是超聲波作用的有效區域為環形，會受到超聲波衰減因素的制約，當提取容器過大時，會形成超聲空白區；另外，變幅桿（超聲探頭）密封在隔音箱中，提取容器使提取量受到很大制約。

2）超高壓輔助萃取法破壞細胞結構，增加目標成分與溶劑的接觸面積，降低傳質阻力，使活性成分迅速溶解，顯著地提高了萃取效率。但將這項技術推廣到大規模工業化還需一些改進，如設備應加以創新，安裝實時溫度檢測設備；將此技術與其他技術（均質化、酶輔助）協同發展。

3）超臨界流體萃取法能夠與氣相色譜和質譜等技術聯用，成為高效的分析手段[37]。超臨界流體設備造價較高，因此設備折舊費大大增加了提取成本。

4）微波輔助萃取法不能提取熱不穩定的成分；目標成分與溶劑的極性對萃取效果影響大，并且不能提取非極性的成分。

5）高壓脈沖電場輔助萃取法能夠具有選擇性的釋放細胞內的可溶性物質，能夠獲得高純度成分，設備通用性比超臨界流體萃取的高[38]。然而，在大規模工業化中仍會限制其發展，主要是工業中較高的安裝成本；萃取效果取決于樣品的導電率，因此需要預處理（洗滌、離心等），從而加大了成本的投入[39]。

3 結語及展望

從食用菌中提取活性成分的綠色方法，主要包括超聲波輔助萃取法、超高壓輔助萃取法、超臨界流體萃取法、微波輔助萃取法以及高壓脈沖電場輔助萃取法。這些方法可以提高提取率，降低能耗，減少溶劑消耗，并提升提取化合物的質量。但是，部分提取過程復雜，可能會對成分的生物活性產生不利影響。因此，創建一個公共的提取食用菌活性成分的數據庫，包括提取活性的方法以及精確的提取條件，可為研究者提供參考和依據。其次，部分提取設備造價過高，不適合中小企業的投產，在保證提取效果的情況下，應探索降低成本的途徑。今后的提取方法發展不僅要綠色，還要向低成本工藝方向發展，為今后食用菌有效活性成份的提取提供更多選擇。