基于GC-MS技術分析不同貯藏年份陳皮揮發性成分差異

劉麗娜，傅曼琴，徐玉娟，吳繼軍，余元善，溫 靖

（1.廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所/農業農村部功能食品重點實驗室/廣東省農產品加工重點實驗室，廣東 廣州 510610；2.廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524000）

【研究意義】陳皮（Pericarpium Citri Reticulatae,PCR）為蕓香科植物橘（Citrus reticulateBlanco）及其栽培變種的干燥成熟果皮［1］，為廣東道地藥材，位列廣東三寶之首。《中華人民共和國藥典》（一部，2005版）收載的陳皮藥材［2］分為陳皮和廣陳皮，其自古即有“陳久者良”的說法，具有行氣、調中、燥濕化痰等功效［3-4］。其中廣陳皮（新會陳皮）因其質優而獨具地道藥材的特色［5］，具有很高的市場價值。陳皮中含有揮發性成分，其揮發油直接作用于腸道平滑肌，可降低正常家兔腸道收縮頻率［6］，對氣管平滑肌有抑制［7］、抗氧化作用［8］。【前人研究進展】以往對陳皮揮發性成分的研究大部分采用提取揮發油的方法［9］。陳彤等［10］采用GC-MS建立8個不同產地22種陳皮揮發油的指紋圖譜，結果表明，22種陳皮揮發油的相似度在0.886～1之間，其中4個地區的樣品獲得了良好區分，而來自廣東云浮、廣西梧州和廣東清遠3個產地的樣品聚成一類，最終確定共有峰中左旋-α-蒎烯、α-法尼烯、β-蒎烯和微量組分中的大根香葉烯為顯著貢獻的主成分組分。裴亞萍［11］用GC-MS法分析以水和食用乙醇作為溶劑制備的陳皮提取物的揮發性香氣成分，并與水蒸汽蒸餾法萃取的陳皮天然揮發性香成分進行成分比對，結果表明：3種樣品經GC-MS分別檢測出17種（陳皮水提取物）、13種（皮乙醇提取物）和9種（陳皮天然香成分）揮發性香氣成分，3種樣品中含有的主要揮發性成分均為糠醛、d-苧烯和α-松油醇。楊元豐等［12］采用主成分分析（PCA）和聚類分析對《中華人民共和國藥典》中4個品種來源的陳皮揮發油GC-MS數據分析比較，通過主成分分析和聚類分析可將廣東新會茶枝柑樣品與其他樣品大致分為兩類。夏倫祝等［13］采用超臨界CO2流體萃取法提取10批陳皮樣品的脂溶性成分，采用GC-MS聯用技術分析陳皮脂溶性成分中的特征成分，結果表明，10批樣品中含有右旋檸檬烯、α-羅勒烯、α-吡喃酮、α-蓽澄茄烯、反式-石竹烯等27種共有成分，其保留時間和峰面積形成了特征性指紋圖譜。周欣等［14］用GC-MS方法分析不同年份新會陳皮揮發油的成分和含量，結果表明，隨著年份增長，新會陳皮揮發油成分含量在3年內隨著時間增長而增加，甚至出現一些新的成分。【本研究切入點】以往研究多采用提取陳皮揮發油結合GC-MS分析研究陳皮揮發性成分，對不同產地、不同來源的陳皮揮發油主成分以及特征香氣成分進行分析并建立指紋圖譜，但并未對檢測到的陳皮揮發性成分全面說明，也未分析不同貯藏年份陳皮中揮發性成分的差異。【擬解決的關鍵問題】本研究采用頂空固相微萃取（HSSPME）結合氣相色譜質譜聯用（GC-MS）的方法對貯藏時間分別為1年（2017年）、5年（2013年）、15年（2003年）的新會陳皮樣品中揮發性成分進行分析，明確不同貯藏時間陳皮揮發性成分的差異，為陳皮的品質鑒定及調控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2017年、2013年、2003年產陳皮均購于江門市新寶堂陳皮有限公司，陳皮來源于同一果園當年12月份所采茶枝柑的成熟果皮，經同一方法陳化制得。

儀器設備：ME204分析天平（瑞士METTLER公司）、RHP-100 高速多功能粉碎機（浙江永康市榮浩工貿有限公司）、HWS-26 電熱恒溫水浴鍋（上海恒科學儀器有限公司）、YH系列電熱器（江蘇近湖鎮教學儀器廠）、GC-MS 6980N/5975B氣相色譜-質譜聯用儀（美國Agilent公司）、手動SPME進樣器、50/30μm DVB/CAR/PDMS纖維萃取頭（美國Supelco公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備 陳皮中揮發性成分測定采用張浩［15］方法，加以修改。先將陳皮剪碎，用打粉機輕微打成粉狀，打粉5 s后立即停止，避免高溫破壞陳皮香氣物質。稱量0.50 g陳皮粉末于固相微萃取樣品瓶中，加入5 mL蒸餾水浸泡20 min。

1.2.2 HS-SPME法 萃取頭活化：250℃條件下，將50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭置于氣相色譜-質譜聯用儀進樣口活化30 min左右，直至色譜檢測無干擾峰出現。HS-SPME：在待測樣品加入磁性攪拌子于65℃恒溫水浴，調整轉速為150 r/min，在電熱恒溫加熱攪拌器中平衡10 min，再將活化好的萃取頭插入樣品瓶的頂空部分，65℃條件下吸附30 min，最后將吸附好分析組分的萃取頭拔出并插入GC-MS進樣器中解吸。

1.2.3 色譜條件 Agilent6890N氣相-色譜儀，色譜柱型號：DB-5 MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：He，流量1.0 mL/min，進樣量1.0 μL，分流進樣20∶1，進樣口溫度250℃；升溫程序：起始柱溫40℃，以10℃/min的速率升溫到70℃，然后以3℃/min的速率升溫到190℃，再以10℃/min的速率升溫到220℃。

1.2.4 質譜條件 Agilent5975B MSD質譜，電離方式EI，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，接口溫度280℃，全程掃描范圍m/z 40-500 AMU/sec。

1.2.5 揮發性成分測定 經頂空固相微萃取后，拔出萃取頭，立即置于氣相色譜進樣口中解吸5 min，進行GC-MS分析。

1.3 分析方法

1.3.1 定性分析 化合物經質譜數據庫檢索與資料庫相匹配，選擇較高匹配度的檢索結果，結合每個峰的質譜數據和化合物的質譜裂解特征，并結合參考文獻中報道的已知化合物確認檢測物成分，對其進行定性分析。

1.3.2 定量分析 單個化合物的質量分數利用峰面積歸一化法進行相對定量，求得各揮發性化學組分的相對百分含量。

2 結果與分析

2.1 陳皮中揮發性成分

如圖1所示，不同貯藏年份陳皮揮發性成分的總離子流圖總體差異不顯著，對其中檢測到的所有成分進行定性檢索，從貯藏年份為2017年、2013年和2003年陳皮中分別檢測出34種、38種和39種揮發性成分，將這些化合物按面積歸一化計算，分別約占總峰面積的 96.78%、99.86%和99.40%。表明隨著貯藏時間延長，陳皮中揮發性化合物種類增加；3個不同貯藏年份陳皮揮發性成分都主要包括烯烴類、醇類、酚類、醛類和酯類化合物，其中D-檸檬烯相對含量最高，達50%～65%，隨陳皮貯藏時間延長，其相對含量逐漸降低，3-蒈烯和γ-松油烯的含量次之，達12%～21%，隨陳皮貯藏時間延長，3-蒈烯含量逐漸增加，而γ-松油烯的含量逐漸減少（表1）。

進一步對不同貯藏年份陳皮中各揮發性成分的相對含量進行比較分析，發現隨著貯藏年限延長，陳皮揮發性組分的種類及相對含量發生顯著性差異，有逐年遞增或遞減的，也有先增后減或先減后增，說明不同揮發性物質的相對含量變化規律不同。

由表1可知，α-側柏烯、蒎烯、γ-松油烯、芳樟醇、香茅醛等15種揮發性化合物相對含量遞減或消失，如γ-松油烯，2017年陳皮相對含量為20.10 %，2013年的相對含量為17.48 %，2003年陳皮中則未檢測到；揮發性物質含量遞增或產生新的揮發性物質的有β-蒎烯、萜品油烯、香芹酚、β-石竹烯、月桂烯、D-香芹酮、石竹素、棕櫚酸甲酯等18種化合物，且只在2003年陳皮的揮發性組分中檢測到月桂烯、百里酚等香氣成分；而某些揮發性成分只存在于某個貯藏年份的陳皮中，本研究檢測到苯類及酮類化合物只存在于2003年貯藏的陳皮中。

圖1 不同貯藏年份陳皮揮發性成分總離子流Fig.1 Total ion flow of volatile components of PCR in different storage years

表1 不同貯藏年份陳皮中揮發性成分及其相對含量Table 1 Volatile components in PCR in different storage years and their percentages

2.2 陳皮中主要香氣成分

陳皮香氣成分主要是萜烯類、醛類、酯類、醇類和酚類等多種含氧化合物，特征香氣成分有D-檸檬烯、β-蒎烯、月桂烯、3-蒈烯、γ-松油烯、檸檬烯、N-甲基鄰氨基苯甲酸甲酯、甜橙醛、癸醛、紫蘇醛、α-松油醇等，達幾十種之多，每種物質對香氣的貢獻大小取決于香氣閾值［16］。在3個不同貯藏年份的陳皮揮發性組分中共檢測到61種化合物（圖2），其中烯烴類物質28種、占80%以上，是主要揮發性成分；醇類物質7種，醛類和酯類物質各6種，烷烴類和酚類物質各4種，苯和萘類物質各2種，醚類和酮類物質各1種。

圖2 不同貯藏年份陳皮主要香氣成分比較Fig.2 Comparison of main aroma components of PCR in different storage years

2.2.1 烯烴類 萜烯類化合物是陳皮揮發性物質中的主要成分［17］。烯烴類化合物是陳皮揮發性成分中含量最高的一類，在不同貯藏年份陳皮中呈顯著差異性（圖2）。在貯藏年份為2017年、2013年、2003年陳皮中分別檢測出18、21、18種烯烴類物質，含量分別為88.42%、94.61%、77.76%。所有烯烴類物質中均以D-檸檬烯含量最高，分別為60.74%、59.05%、54.4%，3-蒈烯含量次之，分別為1.06%、12.23%、17.01%。亞甲基-1-環己烯、萜品油烯、β-石竹烯、α-芹子烯、α－法呢烯等5種物質在3個不同年份陳皮中的含量均大于0.1%。

2.2.2 酯類 酯類物質是陳皮揮發性成分的主要組分，僅次于烯烴類物質。在貯藏年份為2017年、2013年、2003年陳皮中分別檢測出3、3、5 種酯類物質，含量分別為5.93%、3.71%、7.21%。乙酸橙花酯、N-甲基鄰氨基苯甲酸甲酯是3個不同貯藏年份陳皮中的共有成分，N-甲基鄰氨基苯甲酸甲酯的相對含量分別為5.86%、3.63%、6.82%，顯著高于其他酯類物質。乙酸香葉酯、月桂酸甲酯只在2003年的陳皮中檢測到，且含量均低于1%。

2.2.3 醛類 醛類物質也是陳皮揮發性成分的主要組分。由圖2可知，隨著貯藏年限延長，醛類物質的相對含量越來越低，種類也越來越少。在貯藏年份為2017年、2013年、2003年陳皮中分別檢測出6、4、3種醛類物質，含量分別為1.28%、0.84%、0.49%；其中甜橙醛的相對含量最高，隨著貯藏年限延長，其含量先增加后減少；醛類物質對陳皮香氣有重要貢獻，特別是甜橙醛具有愉悅香氣，是陳皮精油特征香氣的主要成分［18］。

2.2.4 酚類、醇類和萘類 酚類物質雖然含量不高，但對陳皮香氣也有一定貢獻。在貯藏年份為2017年、2013年、2003年的陳皮中共檢出4種酚類化合物，香芹酚（0.1%、0.11%、0.18%）和4-異丙基-3-甲酚（0.12%、0.04%、0.17%）是3個不同貯藏年份陳皮的共有物質，且隨著陳皮貯藏年限延長，香芹酚的相對含量逐漸增加；在2003年陳皮種還檢測到百里酚（0.07%）和壬基酚（0.14%）。共檢出7種醇類化合物，含量分別為0.77%、0.13%、0.72，由此可知，隨貯藏年限延長，陳皮中的醇類物質先減少后增加。芳樟醇只在2017年陳皮中檢測到（0.24%），4-萜烯醇只在2013年陳皮中檢測出（0.11%），兩種物質的相對含量均大于0.1%。此外，在3個不同年份陳皮中均檢測出（1S,8aR）-1-異丙基-4,7-二甲基-1,2,3,5,6,8a-六氫萘，含量分別為0.11%、0.2%、0.11%。在2003年陳皮中檢測到D-香芹酮，含量為0.15%。而烷烴類物質只在2013年陳皮中檢測到，相對含量為0.19%。

從3個不同貯藏年份陳皮揮發性成分分析來看，不同貯藏時間對陳皮香氣的影響差異較大，可能與陳皮表面微生物的代謝活動有關［19］，隨著貯藏時間延長，陳皮微生物的積累可能發生變化，從而影響陳皮揮發性成分組成，進而使陳皮的香氣發生變化。

3 討論

本研究以貯藏時間為1年（2017年）、5年（2013年）和15年（2003年）陳皮為對象，分析其揮發性成分差異，從3個不同貯藏年份的陳皮中共檢測出61種化合物，其中貯藏1年、5年和15年陳皮中分別檢測出34種、38種和39種揮發性成分，這一結果相較于提取揮發油［20］檢測到的成分多，原因可能是因為頂空固相微萃取對于一些揮發性組分以及半揮發性組分靈敏度較好，能得到穩定可靠地定性定量結果；對于一些含量較低、低揮發性的組分來說，固相微萃取技術能有效起到一個富集的作用。

本研究結果表明，不同貯藏時間陳皮中D-檸檬烯相對含量最高，并隨貯藏時間延長其相對含量會逐漸降低，邱芷柔等［21］為了最大化獲取陳皮揮發性成分，采用頂空固相微萃取（HSSPME）結合氣相色譜質譜聯用儀（GC-MS）對不同貯藏年份陳皮進行分析，結果表明，3個不同貯藏年份陳皮中共檢出44種揮發性成分，其中含量最高的是陳皮的特征香氣代表D-檸檬烯；Yu等［22］對陳皮揮發油進行分析，主要成分為D-檸檬烯（5.28%）、1-甲基-4-（1-甲基乙基）-1,4-環己二烯（7.7%）、β-月桂烯（2.98%）、a，α-4-三甲基-3-環己烯-1-甲醇（0.94%）、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚（0.87%）和α-蒎烯（0.53%）；Wang等［23］從青皮和陳皮分別檢測出61、59種化合物，指出青皮和陳皮中D-檸檬烯的含量最高，分別占揮發油總量的65.61%，83.14%；以上研究結果與本文研究結果一致，進一步說明陳皮中的主要香氣成分D-檸檬烯的含量最高。此外，Pernice等［24］研究還表明陳皮揮發油中的主要成分萜烯類化合物，具有較強的抗菌和抗氧化活，高蓓［25］研究也發現，廣陳皮揮發油對黃曲霉和漢遜德巴利酵母均有一定抑菌效果，對黑曲霉無顯著抑菌效果。

易倫朝等［26］采用GC-MS和HPLC-DAD聯用技術，對不同年份自貢陳皮和“老化”模擬實驗新會陳皮樣品的揮發油和黃酮類成分進行分析，得到高含量的檸檬烯會使新鮮果皮產生不良氣味，陳皮中檸檬烯的含量逐漸減少，氣味隨之香醇的結論，為陳皮“陳久者良”的說法找到了一定根據。本研究通過HS-SPME結合GC-MS對不同貯藏時間陳皮揮發性成分進行分析，明確陳皮中揮發性成分的變化規律，發現陳皮貯藏時間越久，萜烯類和醛類化合物含量越低，酯類、酚類和醇類物質含量越高；在陳皮貯藏15年間，D-檸檬烯相對含量逐漸減少，但均高于50%，這對研究陳皮陳化品質的形成及其調控具有參考價值。

4 結論

本研究結果表明，隨著陳皮貯藏時間延長，陳皮揮發性物質的種類越來越豐富，烯烴類和萘類化合物相對含量先增加后減少，酯類、酚類和醇類物質含量先減少后增加，醛類化合物相對含量逐年遞減。在陳皮陳化過程中，某些揮發性成分會消失，同時也會生成新的物質，但依然是萜烯類、醛類及酯類化合物等作為揮發性物質的主要成分，其中以D-檸檬烯含量占比最大，達50%～65%。