昆蟲不育分子研究進(jìn)展

楊雨航，黃新意，翁群芳

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局于2017年發(fā)布的《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》，包含441種外來檢疫物種。外來入侵物種嚴(yán)重?fù)p害了經(jīng)濟(jì)和生態(tài)，時常伴隨有疫情暴發(fā)，同時危害了人們的安全，如紅火蟻（Solenopsis invictaBuren）、新菠蘿灰粉蚧（Dysmicoccus neobrevipesBeardsley）［1］。鳳梨盾蚧（Diaspis bromeliaeKerner）、杰克貝爾氏粉蚧（Pseudococcus jackbeardsleyiGimpel＆ Miller）和并蠣蚧（Neopinnaspis harperiMckenzie）是近些年首次入侵傳入我國的適應(yīng)能力極強(qiáng)的代表品種，在短短幾年內(nèi)已經(jīng)從沿海地區(qū)傳入我國內(nèi)陸，對農(nóng)產(chǎn)品的種植和出口有著巨大的負(fù)面影響［2-3］。伴隨氣候變化加劇，害蟲對常用化學(xué)殺蟲劑的抗藥性增加，人們的綠色生態(tài)意識不斷加強(qiáng)，昆蟲不育技術(shù)（SIT）因其具有無污染、無抗性、防效持久、專一性強(qiáng)、對人畜和天敵安全等突出優(yōu)點日益受到重視，已經(jīng)成為有害生物綜合治理（IPM）的重要內(nèi)容［4-5］。

輻照作為SIT中的常用手段受到廣泛研究。輻射處理的雄蟲被釋放到野外與野生雌性交配，從而阻止它們產(chǎn)生可存活后代的SIT，成功地抑制了某些昆蟲種群。60Co-γ射線對靶標(biāo)生物的作用具有隨機(jī)性和復(fù)雜性，既可能改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)，也可能導(dǎo)致基因組單個位點發(fā)生潛在的未知突變或代謝調(diào)控變化等多種路徑異常而產(chǎn)生的綜合效應(yīng)［6］。但因其作用靶點的隨機(jī)性、不確定性導(dǎo)致其難以廣泛應(yīng)用。隨著分子技術(shù)的日趨成熟、昆蟲內(nèi)部的信號傳遞網(wǎng)絡(luò)逐漸探明，其內(nèi)部微觀動態(tài)變化過程受到了廣泛研究，并通過輻照不育啟發(fā)了大量有關(guān)不育技術(shù)的研究。

通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)目前對昆蟲不育的研究大多以生態(tài)種群的宏觀角度進(jìn)行敘述，對其微觀角度的分子研究的論述并不多，同時，總結(jié)各個不育技術(shù)成果并找到其共同之處，以種群控制角度進(jìn)行論述的研究極少。特別是在分子技術(shù)不斷成熟應(yīng)用在昆蟲不育方面時，各種不育技術(shù)的原理特點、適用范圍、針對對象的生理生態(tài)特性及實際使用中的一系列問題等均會對其大范圍使用與開發(fā)造成挑戰(zhàn)，對昆蟲不育技術(shù)開發(fā)亟待解決的研究內(nèi)容較多，涉及生態(tài)環(huán)境、種群基因庫、技術(shù)評價標(biāo)準(zhǔn)及有效分子機(jī)制等。本文整理了數(shù)十年來昆蟲不育技術(shù)發(fā)展變化和主流的分子遺傳防控機(jī)理研究，在全球頻繁交流、加深合作的背景下，總結(jié)前沿的昆蟲輻照不育分子研究內(nèi)容，以防治思路的時間變化為軸，圍繞具體技術(shù)的原理、防治特征、適用原則及實際應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述，為綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展提供了思考，為科研工作者提供借鑒。

1 昆蟲輻照不育技術(shù)的原理及主要方式

1.1 昆蟲輻照不育原理

昆蟲輻照不育技術(shù)是利用射線和中子流對目標(biāo)昆蟲某個蟲態(tài)進(jìn)行輻照處理，導(dǎo)致顯性致死、當(dāng)代或后代不能正常生殖，從而實現(xiàn)害蟲防治的一種物理方法。昆蟲不育的原因有：雌蟲不能產(chǎn)卵，雄蟲不能產(chǎn)生精子或精子失活，不能交配，雄蟲或雌蟲生殖細(xì)胞產(chǎn)生致死突變。輻照效應(yīng)與昆蟲細(xì)胞的分化程度呈反比，與分裂程度呈正比。在細(xì)胞分裂的活躍期，如卵的胚胎發(fā)育期、羽化前和化蛹后的這些時間段較小的輻照劑量就可以致死的。成蟲細(xì)胞的分化程度最高，但是性腺細(xì)胞卻在成蟲細(xì)胞中處于分裂活躍期，對輻照最敏感，較低的劑量即可使昆蟲不育或產(chǎn)生遺傳紊亂的配子，這也是不育劑量比致死劑量低得多的原因。同時，輻照劑量必須破壞雄蟲精原細(xì)胞，防止其恢復(fù)生殖能力，永久破壞形成卵所必需的卵原細(xì)胞或滋養(yǎng)細(xì)胞，輻照的能量傳到核酸鏈上將其打斷，使配子染色體斷裂、精子畸形，還會引起活性氧上升損害多種細(xì)胞途徑和過程；產(chǎn)生水自由基損壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，加劇蛋白質(zhì)和脂肪分解代謝［7-9］。然而使用此類方式進(jìn)行處理的個體，其生活力和交配競爭力等生理指標(biāo)均明顯下降，如棉鈴蟲在輻照后的飛行距離、成蟲壽命較野生種都顯著下降［10］。國際原子能機(jī)構(gòu)（www.iaea.org） 的 IDIDAS（International Database on Insect Disinfestation and Sterilization）數(shù)據(jù)庫（https://nucleus.iaea.org/sites/naipc/ididas/Pages/Browse-IDIDAS.aspx）中包含有害蟲的致死劑量和不育劑量，在2012年共收錄了337種害蟲的輻照處理劑量，在2020年3月IDIDAS數(shù)據(jù)庫收錄的害蟲達(dá)到374種，但是這些數(shù)據(jù)中只有少數(shù)種類的昆蟲有對應(yīng)的殺滅劑量和不育劑量。

1.2 完全不育劑量概述及應(yīng)用

完全不育劑量是指在防治區(qū)域內(nèi)釋放親代不育雄蟲（通過高劑量輻照處理，達(dá)到當(dāng)代不育），跟野生雄蟲競爭，使整個種群數(shù)量下降，達(dá)到對特定種類昆蟲數(shù)量控制的目的。該策略在前期需要大量釋放初始不育雄蟲控制種群數(shù)量，但由于不育只會影響當(dāng)代，故需要定時釋放穩(wěn)定防治效果［11］。釋放不育雄蟲與野生型雄蟲的初始數(shù)量比（釋放比）越高，防治效果越好。從圖1可以看出，通過長時間釋放不育雄蟲能達(dá)到有針對性地控制昆蟲種群的目的。此方式是基于對象昆蟲的生理生態(tài)特性（雌蟲一生交配1次）所選用的，對某些種類的昆蟲適用性強(qiáng)且十分有效。但對于難以人工養(yǎng)殖的昆蟲，且一生多次交配種類的昆蟲并不合適，并且按時釋放以穩(wěn)定防治效果的做法增加了防治成本與難度，這不是一個普遍適用策略。故完全不育劑量限制了昆蟲輻照不育技術(shù)的推廣應(yīng)用。

圖1 完全不育劑量運(yùn)行圖Fig.1 Run chart of completely sterile dose

1.3 亞不育劑量概述及應(yīng)用

1.3.1 亞不育劑量概述 亞不育劑量是指通過釋放低劑量輻照雄蟲，在其與野生雌蟲交配后會產(chǎn)生F1，而F1為不育昆蟲（圖2A）。此現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)于蘋果蠹蛾〔Cydia pomonella（L.）〕中，雄蟲在低輻照處理下，后代為亞不育或全不育，在輻照下雌蟲較雄蟲相比表現(xiàn)出更為明顯不耐受性［11］。在其他鱗翅目昆蟲中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，相同劑量下出現(xiàn)了雌蟲完全不育，雄蟲為半不育，且雌蛹羽化率顯著低于雄蛹的現(xiàn)象。通過60Co-γ射線以亞不育劑量處理小菜蛾〔Plutella xyllostella（Linnaeus）〕，與對照相比，輻照雄蟲的飛行能力、交配能力、對雌蟲性信息素的感知能力均無顯著差異，F(xiàn)1代生殖力受到影響，其產(chǎn)生的F2代死亡率極高，生活力大幅下降，且釋放比為5∶1，大大減少了不育昆蟲的釋放量，降低了防治成本與人工養(yǎng)殖的難度（圖2B）［12］。

與完全不育劑量相比，低劑量增強(qiáng)了輻照雄蟲的競爭配偶能力和生殖力，且亞不育劑量可以適用在大部分種類昆蟲上。盡管相對于完全不育劑量的生活力和競爭力得到了改善，但是依舊對昆蟲造成了傷害。同時，輻照不育技術(shù)必須要解決飼養(yǎng)昆蟲的雌雄分離問題，相同劑量的輻照只能使少數(shù)種類昆蟲的雌性個體不育甚至死亡，因此混合釋放大大降低了防治效率。昆蟲具有明顯的雌雄二型，對于大多數(shù)昆蟲而言，需要一種選擇性標(biāo)記系統(tǒng)實現(xiàn)雌雄昆蟲的大規(guī)模自動分離。

因昆蟲多型性普遍，甚至存在變態(tài)發(fā)育階段，故在選擇輻照蟲態(tài)時需要考慮：（1）方便收集進(jìn)行輻照處理；（2）該蟲態(tài)處理后能保證其最大限度的存活率、壽命、生殖力和交配競爭力［13］；（3）該蟲態(tài)的大規(guī)模釋放對作物、環(huán)境等生產(chǎn)生活資料不產(chǎn)生特別嚴(yán)重的影響［14］。值得一提的是，同種昆蟲不同地理種群間的亞不育劑量也可能不一樣。

1.3.2 亞不育劑量的應(yīng)用前景 對于輻照不育，目前出現(xiàn)了與其他防治方法結(jié)合克服了輻照SIT本身的不足，補(bǔ)充了昆蟲不育體系。胞質(zhì)不相容（Incompatible Insect Technique，IIT）是由于沃爾巴克氏體（Wolbachia）的作用下使得昆蟲精子與卵子無法融合即胞質(zhì)不相容［15］，但缺點是如果雌雄個體均感染了此菌就可以產(chǎn)生后代［16］。沃爾巴克氏體是世界上最常見的寄生微生物，最早在尖音庫蚊（Culex pipiens）體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。它們能感染各種節(jié)肢動物，尤其是昆蟲。這類細(xì)菌只能通過卵來傳播，并且它們善于操控宿主：一些沃爾巴克氏體菌株會使雌蚊未經(jīng)交配就產(chǎn)卵；另一些菌株則會讓雄蚊變成會產(chǎn)卵的雌蚊；還有一些菌株能使受感染的雄蚊精子發(fā)生改變，當(dāng)這些精子讓未受感染的雌蚊卵受精的時候，卵子就會因為細(xì)胞質(zhì)不親和而死亡。而IIT與SIT結(jié)合使用則克服了各自缺點，讓野生白紋伊蚊〔Aedes albopictus（Skuse）〕穩(wěn)定感染了沃爾巴克氏體，并傳播了至少34代，雖然感染了沃爾巴克氏體的蚊子還是能傳播瘧原蟲，但是傳播效率大大降低［17］。原因在于，雖然人工釋放的蚊子全部感染有沃爾巴克氏菌，但是當(dāng)接受不影響活力的低劑量輻射時雌蚊會完全不育，降低了沃爾巴克氏菌感染的雌性意外釋放的機(jī)會，從而大大降低了染菌雌雄產(chǎn)生可育后代的機(jī)率。可以看出，多種防控措施的有機(jī)結(jié)合是未來綠色高效防治害蟲發(fā)展的方向，這項舉措為阻斷蟲媒疾病做出了巨大貢獻(xiàn)，也為害蟲防控建立隔離區(qū)提供了新思路。

圖2 亞不育劑量策略Fig.2 Sub-sterile dosage strategy process

2 自我限定型種群抑制研究

自我限定種群抑制是根據(jù)遺傳學(xué)原理，向自然界中釋放不育或攜帶有害基因的雄蟲，所釋放的遺傳改造昆蟲可將突變基因遺傳給下一代，與自然界的野生雌蟲交配后使其不能產(chǎn)生后代，或有害基因在后代中表達(dá)導(dǎo)致后代死亡，從而使害蟲種群在幾個世代后迅速減少，甚至滅絕。但其不利遺傳因素（如顯性致死基因）會隨著時間推移而消失，因此就需要周期性地釋放基因改造昆蟲到野生種群中以維持抑制效果。

2.1 RIDL調(diào)控機(jī)理及應(yīng)用

2.1.1 RIDL調(diào)控機(jī)理 釋放攜帶顯性致死基因昆蟲技術(shù)（Release of Insects Carrying a Dominant lethal, RIDL）通過基因工程的方法，體外連接昆蟲轉(zhuǎn)座子、特異啟動子、昆蟲顯性致死基因、轉(zhuǎn)錄激活域、熒光標(biāo)記等元件，構(gòu)建了一個復(fù)合轉(zhuǎn)座 子（Transposons with Armed Cassettes,TAC）。基于昆蟲轉(zhuǎn)座子的引導(dǎo)，TAC插入昆蟲基因組中，以遺傳作為傳遞路徑，以此達(dá)到控制害蟲的目的。轉(zhuǎn)基因純合子雄蟲與野生（wt）雌蟲交配后，后代中雌性個體在TAC作用下死亡，雄性存活，經(jīng)歷數(shù)個世代后TAC將在子代中擴(kuò)散，實現(xiàn)害蟲滅絕。

目前使用RIDL技術(shù)構(gòu)建的昆蟲品系分別采用的調(diào)控體系是溫度敏感性致死和四環(huán)素（Tetracycline,Tc）調(diào)控致死，后者為常用手段，是通過四環(huán)素飼喂控制含有致死基因昆蟲生死的技術(shù)［19］。RIDL技術(shù)中Tet-off系統(tǒng)最為常見，由啟動元件（Driver）為特異啟動子驅(qū)動四環(huán)素轉(zhuǎn)錄激活因子tTA（tetracycline dependent transactivator，或經(jīng)密碼子突變改造優(yōu)化的tTAV）與響應(yīng)元件（Effector）組成。響應(yīng)元件包括轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子tetO（tetracycline operator）或包含多個tetO元件的四環(huán)素響應(yīng)元件tRE（tetracycline response element）、最小啟動子（minimal promoter）和效應(yīng)基因（可與性別特異可變剪切體連接）。

其原理為四環(huán)素存在時，tTA與tetO的特異結(jié)合受到抑制，效應(yīng)基因不啟動，昆蟲正常存活；反之，昆蟲死亡［20］。tetO由大腸桿菌（Escherichia coli）四環(huán)素抑制子（tetracycline repreeeor，tetR）的DNA結(jié)合域與病毒HSV1中VP16基因的轉(zhuǎn)錄激活域組成。控制系統(tǒng)又分為單元件和雙元件。當(dāng)效應(yīng)基因為tTA時，此就為單元件系統(tǒng)，會形成正向反饋，通過不斷積累的tTA造成昆蟲死亡（圖3A）；若效應(yīng)基因為凋亡基因（如hid）或Ⅰ型蛋白磷酸酶抑制劑基因（NippⅠ）等，既表達(dá)tTA也表達(dá)其效應(yīng)基因，此為雙元件系統(tǒng)。由于釋放兩性昆蟲會使得防治效率下降，所以目前開發(fā)的是雌性不育RIDL（female specific RIDL，fsRIDL），通過性別特異表達(dá)的啟動子或某些基因（如Actin-4、dsx、tra基因等）的性別特異可變剪切體，將它們與效應(yīng)基因連接，即可實現(xiàn)性別的篩選（圖3B）。RIDL應(yīng)用于埃及伊蚊（Aedes aegypti），利用Actin-4基因的5' UTR具有性別特異性剪切體與效應(yīng)基因VP16融合，特異地在雌性中表達(dá)，使得雌蚊無法飛行，RIDL技術(shù)采用的雙元件系統(tǒng)（圖3C）［21］。

圖3 RIDL系統(tǒng)示意圖Fig.3 Schematic diagram of RIDL system

2.1.2 RIDL在應(yīng)用中的可能模型 RIDL處理的昆蟲與輻照處理相比，不僅解決了性別篩選的問題，同時消除了逃逸昆蟲的可能，并且可以將釋放昆蟲進(jìn)行可遺傳熒光標(biāo)記以有效監(jiān)控。但其不足也較明顯：（1）需要構(gòu)建多個品系進(jìn)行篩選，其昆蟲品系使用不同轉(zhuǎn)座子TAC被隨機(jī)插入基因中，其插入位點決定了效應(yīng)基因的表達(dá)效率和RIDL品系的適合度；（2）對于遺傳信息不清晰的昆蟲進(jìn)行操作會變得困難，因為在構(gòu)建TAC時，會利用目標(biāo)昆蟲的內(nèi)源啟動子、效應(yīng)基因和雌性特異性剪接內(nèi)含子信息；（3）轉(zhuǎn)座子活性可能導(dǎo)致TAC在種內(nèi)或種間漂移，降低了品系的遺傳穩(wěn)定性，進(jìn)而需要通過特定手段使轉(zhuǎn)座子失效；（4）昆蟲種類的繁多、遺傳信息差異也導(dǎo)致構(gòu)建RIDL品系的技術(shù)難度和時間成本增加。

2.2 RNAi技術(shù)

2.2.1 RNAi技術(shù)概述 RNAi（RNA interference）由一種雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘導(dǎo)的內(nèi)源性序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，具有高度保守性。RNAi是dsRNA誘導(dǎo)的多步驟、多因素參與的過程，分為起始階段與效應(yīng)階段。在起始階段中，Dicer酶（序列特異性核酸內(nèi)切酶）起到了關(guān)鍵性的作用，能特異識別dsRNA，當(dāng)dsRNA進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)時會被Dicer酶分解為siRNA（small interference RNA）。在效應(yīng)階段，siRNA與Argonaute蛋白、Dicer酶等多種生物大分子裝配形成復(fù)合物RISC（RNA-induced silenceing complex），通過ATP供能RISC攜帶的雙鏈siRNA變成單鏈siRNA，變成具有活性的RISC（Slicer），此時Slicer與目的mRNA結(jié)合。如果siRNA的無義鏈與mRNA不互補(bǔ)，則復(fù)合體離開mRNA；反之，則置換出siRNA有義鏈，RNAaseⅢ從siRNA的無義鏈一端開始剪切mRNA，形成25 nt的小分子RNA，而這些小分子RNA在核酸酶的作用下降解，翻譯階段被破壞，實現(xiàn)目的基因沉默。將RNAi應(yīng)用進(jìn)昆蟲遺傳中，促使雌性后代特異性表達(dá)進(jìn)行基因沉默，實現(xiàn)控制害蟲的目的。

2.2.2 RNAi的應(yīng)用 對100種昆蟲的轉(zhuǎn)錄本研究中，編碼這些蛋白的核心RNAi途徑基因系統(tǒng)起源相似，充分說明了該技術(shù)的可行性［22］。橘小實蠅〔Bactrocera dorsalis（Hendel）〕中的雄性生殖相關(guān)基因gld2、tim、rae1和gudu使用RNAi后生殖力受到了顯著影響，單雌產(chǎn)卵率顯著下降［23］。對于鞘翅目昆蟲，沒有GGU這種特定序列，RNAi在使用上更加方便，效率更高。在鱗翅目昆蟲中使用某些dsRNA不會沉默，反而使目標(biāo)基因表達(dá)上調(diào)，在亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）使用dsGFP和dsMLP共誘導(dǎo)了160個基因上調(diào)、44個基因下調(diào)，說明dsRNA的結(jié)構(gòu)會引起防御性蛋白的表達(dá)［24］。在昆士蘭果蠅（Bactrocera tryoni）中以tssk1、topi和trx為靶點基因可在不影響雄性競爭力的情況下，顯著影響生殖力［25］。在鱗翅目昆蟲中用RNAi抑制dsRNase基因可增強(qiáng)RNAi的效率［26］。小分子RNA降解時，其堿基排列為GGU為酶解位點，并且此排列具有普遍性［27］。

諸多因素限制著RNAi的推廣應(yīng)用：（1）dsRNA序列導(dǎo)致了siRNA數(shù)量存在差異；（2）目前dsRNA通過注射或飼喂的方法，在血淋巴和唾液中存在核酸酶水解的情況。在鱗翅目昆蟲中還發(fā)現(xiàn)由up56基因編碼特異性核酸酶REase抑制了RNAi［28］。研究表明，雙鏈核糖核酸酶（dsRNases）、內(nèi)切體包埋、核心機(jī)制功能缺陷、dsRNA的脫靶效率低和免疫刺激不足是限制RNAi效率的原因［29］。

3 自我維持型種群替代研究

基因驅(qū)動是指某些特定基因型或特定性狀在種群中被有偏好性地遺傳給后代的現(xiàn)象，也稱為超孟德爾遺傳（super-Mendelian inheritance）。自我維持型種群替代是通過基因驅(qū)動，將某些特定基因型或特定性狀（具有輕度危害的良性基因）遺傳給后代，以此替代自然界中具有嚴(yán)重危害作用品系的防治策略［30］。與自我限定型種群抑制相比，它具有更強(qiáng)的針對性和滲透作用，甚至可以改造種群，具有兼顧生態(tài)多樣性保護(hù)和控害效益提高的特點。

3.1 基因編輯技術(shù)

這種策略的實施主要依靠于基因編輯技術(shù)的成熟應(yīng)用。CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一種由單鏈向?qū)RNA（single-guide RNA, gRNA）指導(dǎo)的Cas核酸酶對靶向基因進(jìn)行特定DNA修飾的技術(shù)［31］。在基因編輯中Cas9蛋白（來源于釀膿鏈球菌Streptococcus pyogenes）應(yīng)用最廣，Cas9內(nèi)切酶在向?qū)RNA〔識別保守的間隔相鄰基序（proto-spacer adjacent motifs, PAM基序）〕的指引下能夠?qū)Ω鞣N入侵的外源DNA分子進(jìn)行定點切割。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)由兩部分組成，一部分是可以使dsDNA斷裂產(chǎn)生平末端的Cas9核酸酶，另一部分是與Cas9相結(jié)合并可與靶標(biāo)基因反義鏈序列結(jié)合的一段20 nt長的gRNA，在靶標(biāo)基因上還需要有一個可以使Cas9可識別的PAM（NGG的序列）［32］。

crRNA（CRISPR-derived RNA）通過堿基配對與反式tracrRNA（trans-activating RNA）結(jié)合形成tracrRNA/ crRNA復(fù)合物（可以將crRNA和tracrRNA的表達(dá)融合到一起成為一個gRNA），此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對的序列靶位點剪切雙鏈DNA［33］。gRNA引導(dǎo)序列靶定位點剪切雙鏈DNA達(dá)到對基因組DNA修飾的目的［34］。切割DNA后會產(chǎn)生DSBs通過非同源末端連接修復(fù)機(jī)制（non-homologous end joining, NHEJ）可引起插入或缺失突變（insertion and deletions,Indels），從而改變靶標(biāo)基因的開放閱讀框，引起基因敲除；通過同源重組修復(fù)機(jī)制（homology directed repair, HDR）可插入外源序列，并產(chǎn)生等位基因［35-36］。隨著該技術(shù)的發(fā)展，已在30種昆蟲中應(yīng)用，也在非模式昆蟲建立了基因編輯方法，對于昆蟲基因功能研究幫助巨大［36］。基于CRISPR剪切DNA的兩種修復(fù)方式均會導(dǎo)致突變，產(chǎn)生抗CRISPR的基因序列［25］

3.2 誘變鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

3.2.1 誘變鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)原理 誘變鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（mutagenic chain reaction, MCR）是基于CRISPR/Cas9技術(shù)編輯插入一個誘變體到目標(biāo)基因，該誘變體通過自促性誘變將其同源染色體上的等位基因替換，產(chǎn)生純合等位基因個體的現(xiàn)象。誘變體由三部分組成：（1）編碼Cas9蛋白的中心片段（在體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中表達(dá)）；（2）感興趣的基因序列g(shù)RNA；（3）Cas9/gRNA片段位點兩側(cè)的同源臂（HA1和HA2）與被切基因組靶點兩側(cè)的序列相匹配。通過Cas9引起的雙鏈斷裂的兩種修復(fù)方法，一種是通過Rad51蛋白進(jìn)行HDR，可將姐妹染色體的序列信息復(fù)制到切割位點，另一種是通過Ku70/80蛋白進(jìn)行NHEJ，會導(dǎo)致插入信息錯誤或刪除某些序列。在gRNA引導(dǎo)下Cas9切割基因組靶點，隨后通過HDR將Cas9/gRNA片段插入該位點，然后由HDR驅(qū)動的Cas9/gRNA片段傳播給姐妹染色體,只有當(dāng)Cas9/gRNA片段來自反義鏈才能利用細(xì)胞的內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制，復(fù)制到另一個染色體上產(chǎn)生自純合等位基因。此遺傳規(guī)律繞開了孟德爾遺傳規(guī)律，這是一種主動遺傳。盡管其他形式的主動遺傳學(xué)也能繞開孟德爾遺傳規(guī)律（如轉(zhuǎn)座子RIDL和RNAi），但MCR提供了更為靈活的編輯功能。對個體的MCR進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)有部分的Cas9切割并沒有進(jìn)行NHEJ，而是進(jìn)行了HDR，這種修復(fù)不僅降低了基因轉(zhuǎn)化效率，而且這種突變會不利于攜帶MCR個體的生存，可能形成wt抗MCR的等位基因［37］。

3.2.2 MCR的修復(fù)方式與優(yōu)勢 將Cas9突變的情況嚴(yán)格限制在生殖細(xì)胞中可以針對特定位點，進(jìn)而抑制基因驅(qū)動的發(fā)生。有兩種方法可以針對MCR所導(dǎo)致的抗性基因的出現(xiàn)，去除變異基因的影響：

（1）自促性鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的逆轉(zhuǎn)元件（Elements for Reversing the Autocatalytic Chain Reaction，ERACR）可以去掉并替代MCR。ERACRs（需提供外源Cas9）的gRNA與MCR的Cas9在反義鏈上結(jié)合，將元件去除并替換。ERACRs相較于MCR是保守的，因其無編碼Cas9的序列故不能在野生種群中傳播，而且也不會有基于Cas9的基因突變從而減少突變積累，甚至可以恢復(fù)MCR所改變的基因功能［38］。但是也有它的局限性，當(dāng)gRNAs相似時MCR會破壞ERACRs形成NHEJ阻止MCR缺失，同時，對于ERACRs擁有了抗性的MCR基于HDR也可在種群中傳播。為了減少此類情況，就是將ERACRs的切割位點放在距離MCR較遠(yuǎn)的位置（＞1 kb）。

（2）自促性鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的搭便車結(jié)構(gòu)（Constructs Hitchhiking on the Autocatalytic Chain Reaction，CHACR）可作用于染色體的其它位點，與MCR并行復(fù)制用于替換修復(fù)。CHACRs是攜帶1個或多個gRNAs結(jié)構(gòu)（不以MCR為靶點）的元件，CHACRs可將其他基因組當(dāng)作靶點，通過插入CHACR到基因組引發(fā)NHEJ。當(dāng)Cas9脫靶突變了1個位點，可設(shè)計1個CHACRs通過與MCR雜交，重新編碼突變位點進(jìn)行替換修復(fù)［39］。CHACR傳播到種群中，隨后使用ERACRs去除MCR使其恢復(fù)到wt。ERACRs的靶點也會出現(xiàn)在CHACRs（通過攜帶針對Cas9的gRNAs）上，這使得CRISPR更加靈活。通過使用類似的gRNAs品系與MCR品系雜交的方法，可讓后代中的MCR或CHACR自動去除不能編輯的等位基因，并且HDR會使用對gRNA有抗性的同源模板修復(fù)突變。這種搭便車的模式讓CHACR與MCR得以關(guān)聯(lián)傳播。CHACR攜帶一個或多個gRNAs（可通過同一的途徑激活）沉淀在（非）靶標(biāo)基因，用以滅活 MCR［40］。

自我維持型種群抑制僅僅成功控制了少數(shù)害蟲，隨著人們對物種多樣性認(rèn)識的加深，種群替代已經(jīng)成為遺傳控制的首選。顯然，該技術(shù)的成熟應(yīng)用對于以后復(fù)雜的轉(zhuǎn)基因和孟德爾遺傳規(guī)律組合，可以更好地針對蟲媒疾病與入侵物種，甚至是某些疾病。在不針對個體存亡時從技術(shù)上可以看出：（1）MCR對生態(tài)影響極小，甚至不傷害昆蟲種群；（2）MCR群體不會持續(xù)單獨(dú)存在，它們能夠分散進(jìn)入相鄰的同一種群中進(jìn)行交配，不會存在隔離的情況，能夠比較溫和地將MCR混入wt種群，回顧自我限定型種群抑制則不會；（3）CHACR和ERACR的聯(lián)合使用增加了靈活性，做到了精準(zhǔn)的“外科手術(shù)”，是對生物分子機(jī)理的人為實踐，具有應(yīng)用價值。

3.2.3 精確誘導(dǎo)不育技術(shù)的應(yīng)用 精確誘導(dǎo)不育技術(shù)（precision guided SIT, pgSIT）是基于CRISPR的精確誘導(dǎo)昆蟲不育顯性遺傳技術(shù)，該技術(shù)在卵期就開始篩選性別并使雄性不育。通過pgSIT系統(tǒng)能精準(zhǔn)地針對雌性致死基因與雄性不育基因，讓其后代產(chǎn)生100%的不育雄蟲，與自限性技術(shù)相比擁有更高的效率（圖4）。主要作用方式為，分別構(gòu)建兩個轉(zhuǎn)基因品系（通過CHACR和ERACR做到穩(wěn)定繁殖），A品系表達(dá)dgRNAs（double-guide RNAs），B品系表達(dá)Cas9蛋白，通過單向交配使得兩邊被同步引導(dǎo)并敲除了顯性等位基因，在后代中將隱性性狀轉(zhuǎn)化為顯性性狀，這種方式產(chǎn)生的后代競爭力與wt相比沒有差別［41］。在雌性果蠅中挑選性別特異基因Sxl（sex lethal）和Tra（transformer），在雄性中挑選出生育基因dsxF（doublesex）和βTub（βTubulin 85D），Sxl可使雌性致死，βTub則可使雄性不育［42］。將他們組合在一起構(gòu)建出 dgRNAβTub,Sxl，dgRNAβTub,Tra和 dgRNAβTub,DsxF對生殖競爭力無影響的A品系；B品系表達(dá)nos-Cas9也對其生活力無影響。dgRNAβTub,Sxl與B交配后可產(chǎn)生100%的雄性不育后代，不會產(chǎn)生雌性；而dgRNAβTub,Tra和dgRNAβTub,DsxF雌性會轉(zhuǎn)化為無法生育的個體（intersex，♀），雄性則完全不育。通過上述的CHACR和ERACR可以做到精準(zhǔn)控制品系的產(chǎn)生而不會影響各品系內(nèi)個體的正常繁殖。在F1中dgRNA出現(xiàn)了反式表達(dá)的情況，但依舊不影響表型。由于分別插入了兩種gRNA至同源染色體的等位基因上，因此依賴CRISPR的pgSIT能促使DNA斷裂并進(jìn)行NHEJ修復(fù)，而不是誘導(dǎo)HDR。

明顯優(yōu)點：（1）pgSIT的抗性積累是不存在的。因為純合品系分別培養(yǎng)然后交配產(chǎn)生不育雄蟲，即不能產(chǎn)生可存活后代，從而限制了CRISPR靶位點的選擇壓力；（2）自然遺傳多樣性也不太可能構(gòu)成問題。考慮到pgSIT雄性的作用只是尋找wt雌性交配，從而減少種群數(shù)量；（3）卵的釋放讓運(yùn)輸保存大大簡化，并且做到了防治區(qū)域可控。孵化的幼蟲消耗了原本可繁殖幼蟲的資源，這點與fsRIDL相似，但不會對生態(tài)產(chǎn)生影響。唯一可能的缺點在于，Cas9的脫靶幾率是有的，這點與輻照不育的隨機(jī)性是相似的，這也是引起某些不育雄性環(huán)境適應(yīng)性低的主要原因［43］。

圖4 pgSIT 模式［40］Fig.4 Mode of pgSIT［40］

4 討論與展望

農(nóng)業(yè)害蟲防治的未來應(yīng)該是創(chuàng)造出一種簡便、易控、生態(tài)友好型的自我維持型種群替代技術(shù)。自我限定型種群抑制對于整個環(huán)境而言是具有風(fēng)險的［44］，而自我維持型種群替代受到了廣泛重視。首先，應(yīng)通過輻照結(jié)合分子技術(shù)的手段找尋昆蟲對不同劑量產(chǎn)生耐輻照性的根本原因；其次，通過成熟的pgSIT創(chuàng)造出低耐輻照性品系并在野生種群中傳播；最后在不影響生態(tài)的情況下通過區(qū)域內(nèi)大范圍低劑量輻照甚至通過紫外光，促使目標(biāo)害蟲達(dá)到不育效果，實現(xiàn)控制種群的目的。這種做法不僅解決了昆蟲飼養(yǎng)的問題，更是做到了對生態(tài)最大限度的保護(hù)。

不育策略在實踐中需謹(jǐn)慎。在加拿大針對輻照蘋果蠹蛾Cydia pomonella（L.）防控進(jìn)行了長達(dá)25年的跟蹤研究發(fā)現(xiàn)，種植者會反對這種產(chǎn)生不育后代的措施，原因是：（1）與直接使用農(nóng)藥相比起效時間太長，并要保證不育蛾與野生蛾交配的同步性，即應(yīng)在野外種群大量交配的時期且集中分布的地塊釋放不育昆蟲，才能達(dá)到干擾繁殖的目的；（2）滯育的野生幼蟲出現(xiàn)的概率大，在種植時間長的果園里應(yīng)及時對控制區(qū)內(nèi)的老樹進(jìn)行清理；（3）人工飼養(yǎng)的輻照蛾應(yīng)該與外界的環(huán)境需相似，否則釋放時輻照蛾不適應(yīng)環(huán)境會大量死亡；（4）使用輻照蛾之前需要先將其野生種群密度降到最低，才利于控制害蟲種群。有研究發(fā)現(xiàn)寄生蜂和輻照蛾聯(lián)用可以極大地提升防治效果［45］。可見，目前公眾對于此類技術(shù)秉持懷疑，因此研究者應(yīng)該注意宣傳促成公眾態(tài)度和科學(xué)研發(fā)的互動，從而建立健全國家政策，達(dá)到良性循環(huán)使技術(shù)真正造福于民。

實踐中所出現(xiàn)的問題是不育技術(shù)投入使用的重要一環(huán)，表明技術(shù)的真正開展需要對昆蟲生態(tài)、生理學(xué)等多種學(xué)科加深了解才能充分發(fā)揮其長處，這也對科研工作者提出了更高的要求。可以看出任何不育技術(shù)都是需要對靶標(biāo)昆蟲的規(guī)模化養(yǎng)殖，故昆蟲的飼養(yǎng)是該技術(shù)的主要瓶頸，但目前大多數(shù)昆蟲的人工飼養(yǎng)尚不成熟，因此要大規(guī)模的推廣必定需要重視昆蟲工廠化大規(guī)模飼養(yǎng)技術(shù)的研究開發(fā)。

本文總結(jié)了過去10年間昆蟲不育技術(shù)在防治側(cè)重點上的動態(tài)變化，可以看出思路的轉(zhuǎn)變帶動了技術(shù)的變革，并且不斷完善昆蟲不育體系。目前研究已經(jīng)達(dá)到了分子操作的層次，由于針對的是微觀層面，可能更加難以察覺，需要科研工作者加大對物種基因庫變化與風(fēng)險的檢測，如蛋白通路變化、基因的融合表達(dá)等。科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展使得這些技術(shù)相互融合并碰撞出了更為耀眼的火花，為未來科學(xué)防控提供了無限可能。