甲基磺酸乙酯對穿心蓮種子成苗的影響

周 芳，梅 瑜，顧 艷，蔡時可，王繼華

（廣東省農業科學院作物研究所/廣東省農作物遺傳與改良重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】穿心蓮〔Andrographis paniculata（Burm.F.）Nees〕為爵床科（Acanthaceae）穿心蓮屬（Andrographis）1年生草本植物，別名一見喜、苦草、印度草和橄欖蓮等，是我國常用的大宗中藥材之一，在東南亞國家也具有悠久的民間用藥歷史［1］。其性味苦、寒，歸心、肺、大腸、膀胱經，主要藥用成分為穿心蓮內酯、新穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯等二萜內酯類化合物，具有抗菌消炎、清熱解毒和消腫止痛等功效，臨床多應用于呼吸道感染、腸胃炎、糖尿病和高血壓等心血管疾病的治療，被稱為“中藥抗生素”［2-6］。穿心蓮是利膽消炎片、注射液的主要原料，也是重要的中獸藥主要成分，廣泛應用于畜禽養殖業，其藥用市場前景廣闊，具有良好的發展潛力［7-10］?！厩叭搜芯窟M展】目前在穿心蓮突變體創制上主要的誘變技術包括航天誘變、物理誘變和化學誘變［11-12］。其中，化學誘變成本低、操作簡單，但通過人工方法產生常規育種中難以獲得新性狀，對植物品種的定向改良和新種質資源的創制具有重要作用，在植物育種和基因功能研究中應用廣泛［13-14］。在穿心蓮種子誘變研究中，0.075%秋水仙堿誘導穿心蓮種子24 h，獲得的同源四倍體無菌苗的上、葉下表皮氣孔特征與二倍體無菌苗相比均存在顯著性差異［15］。大氣壓等離子體處理穿心蓮種子，可產生突變植株并且突變率和種子的含水量相關［16］。甲基磺酸乙酯（EMS）是常用的植物化學誘變劑，具有誘變頻率高、點突變多、變異類型豐富和易操作等優點，被廣泛用于植物育種和分子生物學研究［14-17］。EMS誘變技術在農作物上的應用較為成熟，在蔬菜、糧食作物和花卉上較多，獲得具有農藝和品質性狀豐富的突變類型后代群體，如耐濕性甘藍型油菜突變體［18-19］?！颈狙芯壳腥朦c】作為藥用植物，穿心蓮閉花受精的生物學特性阻礙了群體內遺傳多樣性的發生，種質資源遺傳背景較窄，傳統雜交育種相對受限［20-21］。利用各種基因突變技術創制新的種質資源逐漸受到青睞。目前，EMS誘變技術在中草藥方面的研究相對較少，誘導穿心蓮突變體的研究未見報道。穿心蓮EMS誘變研究可以豐富誘變育種材料并加快育種進程、提升育種水平、創新優良品種、保障野生中藥材資源的可持續利用?！緮M解決的關鍵問題】通過比較分析EMS溶液的不同濃度和處理時間對種子萌發及幼苗生長過程的影響，獲得穿心蓮突變體庫建立的最優條件，建立穩定的穿心蓮EMS誘變技術；并對誘變后表型有差異的植株進行形態學方面的評價與鑒定，獲得突變表型豐富的突變體庫，為穿心蓮在功能基因組學方面的研究及新種質選育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

穿心蓮種子為河北省農林科學院溫春秀研究員提供，為福建漳州生產用種。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子處理 將穿心蓮種子置于1%洗潔精溶液中完全浸泡，超聲波清洗處理60 min。清潔完畢后用自來水清洗數遍，再用自來水浸泡處理12 h，取出用紗布擦干穿心蓮種子表面的水分。將預處理好的種子放入質量分數0.5%、0.8%的EMS溶液中，恒溫振蕩培養4、8、12 h。于2019 年10月種植于泥炭土和珍珠巖配比為3∶1的培養土，置于溫度26℃、濕度80%培養箱中培養。以未經EMS處理的穿心蓮種子萌發的幼苗為對照。

1.2.2 種子發芽與幼苗指標調查 2020年3月，對植株的表型進行觀察統計。

株高：穿心蓮種子播后35 d，測量幼苗株高，每個處理4次重復，每個重復50株，選對角線5株測量株高。

1.2.3 數據統計分析 數據采用IBM SPSS（Version 19.0）分析軟件進行統計學分析，運用LSD（Least-Significant Difference）最小顯著性差異法進行多重比較，該方法由英國統計學家Fisher 提出，對兩個或多個樣本平均數差異顯著性檢驗，具有敏感性高的優點。

2 結果與分析

2.1 EMS對穿心蓮種子萌發的影響

2.1.1 對種子發芽率的影響 穿心蓮種子發芽較為緩慢，隨著播種時間延長，發芽率逐漸升高，播種6 d后，每隔2 d統計1次。發芽高峰在播種后10 d左右，發芽率在37.50%～64.50%。其中，0.8%EMS處理4 h的種子在播種14 d時發芽率最高，達到80.00%；而處理8 h的最低，播種14 d時僅為50.50%。對照種子在播種后6～8 d才開始發芽。低EMS濃度、短處理時間的種子發芽早，發芽率高于對照，隨著EMS處理時間延長和處理濃度升高，發芽率隨之降低，呈負相關，且EMS濃度比處理時間對種子萌發的抑制作用明顯（表1）。

2.1.2 對幼苗生長的影響 對播種22 d成活的幼苗數進行調查統計，其成苗率和相對成苗率見表2。同一濃度下，穿心蓮的成苗率和相對成苗率隨EMS處理時間延長總體呈負相關。其中，EMS濃度為0.5%、處理12 h的種子成苗率和相對成苗率最低。EMS濃度為0.8%、處理4 h種子的成苗率和相對成苗率顯著高于對照。幾種處理方式對穿心蓮種子的成苗率和相對成苗率均表現出不同程度的影響。EMS濃度為0.5%、處理8 h的成苗率高于其他兩個處理時間，但差異不顯著。處理時間為4 h的兩個不同濃度處理，株高和對照相比均無顯著差異。隨著EMS濃度增加和處理時間延長，穿心蓮幼苗植株高度下降，和對照、處理4 h的株高存在顯著差異。可見，EMS對穿心蓮幼苗生長的影響優先表現在對植株生長高度的抑制，且EMS濃度提高和處理時間延長抑制幼苗的前期生長。

2.2 穿心蓮突變類型鑒定

對EMS誘變的穿心蓮植株群體在生物學和形態學方面的性狀進行調查，發現一些突變植株在葉型、葉色、葉序、株高、株型和花軸等形態上與正常植株（圖1A、E）表現出明顯差異。（1）葉部突變（圖1B、C、D）。與對照相比，經EMS處理的穿心蓮表現出淡黃雜斑葉、單片葉色加深或者一葉對稱兩色等變異，可能與EMS參與促進或抑制葉綠素的合成有關。葉型上出現較多葉裂、心形葉等，隨著植株生長，這些變異葉片出現死亡，部分可恢復正常生長。主莖葉序出現由正常株的單葉對生變異為單葉輪生，且輪生葉隨著植株的生長依然保持穩定的輪生葉序。（2）花軸變異（圖1F、G）。由對生葉變異為輪生葉的植株，其輪生葉的葉腋處均可抽出花軸，形成輪生型花軸。此外，在誘變的植株中還發現多株無花序軸型植株，其小花花柄直接著生于主莖或分枝上。（3）株型突變（圖1H）。在EMS誘變種子長成的植株群體中，其株型也出現較多變異，對比正常株型，少數誘變植株出現矮化型、節間縮短等特異株型。（4）分枝（圖1I）。正常的穿心蓮植株從主莖的對生葉腋處抽出分支，誘變的分株從底部直接產生分枝，形成兩個以上主莖。（5）物候期突變：經EMS誘導處理的穿心蓮植株，大多與對照保持一致的花期和生長速率，少數突變體在開花期沒有開花，甚至無花軸抽出。

表1 不同EMS處理條件對穿心蓮發芽率的影響Table 1 Effects of different EMS treatment conditions on the germination rates of Andrographis paniculata

表2 不同EMS處理條件對穿心蓮幼苗生長的影響Table 2 Effects of different EMS treatment conditions on the growth of Andrographis paniculata seedlings

圖1 穿心蓮EMS誘導變異類型Fig.1 Variation types of Andrographis paniculata induced by EMS

2.2.1 EMS處理誘導的變異率 從表3可以看出，0.5%、0.8%兩種濃度的EMS處理4 h，均不能產生突變體植株。但隨著處理時間延長，突變率上升。其中0.5%EMS處理 12 h誘變率最高（3.5%），適量延長處理時間可提高穿心蓮種子的誘變率。

表3 不同EMS處理誘導穿心蓮的誘變率Table 3 Mutagenesis rates of Andrographis Paniculata induced by different EMS treatments

3 討論

穿心蓮是我國重要的中藥材之一，但存在生物學特性不一致和品種混雜退化等現象。穿心蓮易受生長環境、栽培條件、加工處理等因素影響，產量和質量不穩定，選育抗逆性強、產量高、有效成分高的優良品種是穿心蓮產業發展的基礎。由于穿心蓮是國外引入物種，且引入時間不長，分布區域有限，種質資源匱乏，因而穿心蓮的良種選育成為亟待解決的問題。目前，突破穿心蓮育種瓶頸、創新穿心蓮種質是進行穿心蓮品種改良的基礎，誘變是重要創新途徑之一［22］。同時獲得具有特異發育表型的突變體材料對于開展植物基因功能研究具有重要意義［23］。EMS誘導是目前生產運用較多的一種突變體制備方法，具有突變率高、操作易控、基因組損傷小、經濟實用等特點，逐漸成為獲得大量突變體樣本的優勢技術［24-26］。不同品種穿心蓮的蠟質層以及內含的發芽抑制物有一定差異，可能和穿心蓮品種特性密切相關。本研究中穿心蓮種子發芽率均不高，最高僅為80%，可能與穿心蓮表面有蠟質層、種皮致密且堅硬、內含有發芽抑制物且存在外致性和生理性休眠有關［27］。對穿心蓮種子進行EMS誘導應根據其品種特性，基于種子的半數致死劑量進一步優化最適宜穿心蓮的誘變條件［28-29］。

本研究發現了一些無花軸的穿心蓮突變體植株和生殖生長階段延遲的突變體植株，可能是EMS對其生殖器官的形成（花等）或在生殖生長過程中產生一定抑制作用，后期需進一步進行相關方面的研究論證。在幼苗階段，誘變植株的葉色和葉片形狀出現多種變異，隨植株不斷生長，葉片顏色的部分突變性狀逐漸消失，表型不再明顯，和紫花苜蓿等在EMS誘變中出現的現象相似［29］。這可能是隨著植株生長而逐漸消除EMS對葉片顏色產生的影響，具體原因有待進一步解析，也將是我們后期研究的重要關注點之一。EMS誘導為穿心蓮的誘變育種和功能基因組研究可提供表型豐富的遺傳材料，對穿心蓮新品種選育提供新的材料。

4 結論

本研究結果表明，穿心蓮種子萌發率與EMS處理濃度和處理時間呈負相關性，其中，0.5%EMS處理12 h為穿心蓮種子的最佳誘變條件，建立了穩定的穿心蓮EMS誘變技術。獲得突變表型豐富的突變體庫，為穿心蓮育種提供了新型種質和突變體資源，為穿心蓮功能基因組學及新品種選育提供新材料。