噬菌體對日本沼蝦常見細菌性疾病的防治效果研究及其應用

杭小英 于喆 呂孫建

摘要：從3個日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）養殖池塘的水體、蝦中分離得到41個菌株，經16S rDNA基因序列分析，結合菌落形態觀察，水體分離到的菌株初步鑒定為芽孢桿菌屬、氣單胞菌屬、腸桿菌屬等，蝦肝胰腺中分離的菌株初步鑒定為氣單胞菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌科等。采用滴注法檢測了噬菌體NTHP01對分離到的細菌的抑菌效果，結果表明，噬菌體NTHP01對芽孢桿菌、氣單胞菌、不動桿菌、腸桿菌、檸檬酸桿菌、原生節桿菌、鄰單胞菌、格氏乳球菌等均具有較好的裂解作用。將噬菌體NTHP01制劑在日本沼蝦養殖塘進行示范應用，初步結果表明日本沼蝦產量提高338～412 kg/hm2，產值提高2.25萬～3.00萬元/hm2。

關鍵詞：噬菌體;日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）;細菌性疾病;防治

中圖分類號：S945.1 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）17-0097-04

Abstract： 41 bacterial strains were isolated from water and shrimps of three Macrobrachium nipponense ponds， by 16S rDNA gene sequence analysis and colony morphology observation， the strains from water were preliminarily identified as Bacillus megaterium， Aeromonas caviae， Enterobacter roggenkampii，et al， the strains from shrimp were preliminarily identified as Aeromonas caviae， Citrobacter murliniae， Enterobacter roggenkampii， et al. The phage NTHP01 inhibition of bacteria was detected by drop injection methodthe results showed that， phage NTHP01 had good cracking effect on Bacillus， Aeromonas， Acinetobacter， Enterobacter， Citrobacter， Arthrobacter protophormiae， Orthomonad， Lactococcus garvieae， et al. Phage NTHP01 preparation was appliled in shrimp breeding pond， the preliminary results showed that， the yield of Macrobrachium nipponense increased by 338～412 kg/hm2， and the output value increased by 2.25 ten thousand ～3.00 ten thousand yuan/hm2.

Key words： phage; Macrobrachium nipponense; bacterial diseases; control

日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）俗稱河蝦、青蝦，隸屬于十足目（Decapoda）長臂蝦科（Palaemonidae）沼蝦屬（Macrobrachium）。據漁業年鑒統計，2016年中國日本沼蝦養殖總產量已達到27.26萬t[1]，是中國產量較高的淡水養殖經濟蝦類之一。日本沼蝦肉質鮮嫩、口感細膩，在上海、浙江、江蘇等地廣受消費者的歡迎。目前日本沼蝦養殖過程中，最大的不利因素仍然是病害，養殖管理中稍有疏忽，極易暴發紅體病、弧菌病、軟殼癥等細菌性疾病，給養殖戶造成嚴重的經濟損失。養殖戶通常采用化學藥物和抗生素進行養殖環境的改善和病害的控制，但化學藥物的使用易對生態環境造成不良影響，抗生素的長期使用也會帶來細菌耐藥性、抗生素殘留等負面影響。為了保護生態環境，提高水產品質量安全水平，抗生素替代藥物的研發顯得尤為重要。而噬菌體是一種可入侵細菌內繁殖，最終使細菌裂解的病毒，它可以“殺死”宿主菌，達到預防和治療細菌性疾病的目的，又與細菌耐藥性無關，是一種很有應用前景的抗生素替代療法。農業部淡水漁業健康養殖重點實驗室從中華鱉養殖塘中分離純化獲得1株噬菌體（NTHP01），前期已開展了生理特征和噬菌作用研究，為進一步拓展噬菌體在日本沼蝦養殖中常見的細菌性疾病的防治作用，本研究開展噬菌體對日本沼蝦養殖塘中分離細菌的抑菌試驗，并在生產中示范應用，為后續在養殖生產中應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 日本沼蝦、水樣 試驗用的日本沼蝦、水樣來自浙江省德清縣下渚湖街道塘涇村、雙橋村的3個日本沼蝦養殖場。每個養殖場選擇1個養殖塘，各隨機采日本沼蝦樣品20余只，用采水器采集池塘近底層水樣1瓶。

1.1.2 噬菌體 從中華鱉養殖塘分離得到的氣單胞菌噬菌體（NTHP01），保存于農業部淡水漁業健康養殖重點實驗室。

1.1.3 培養基 從日本沼蝦、池塘水樣中分離、培養細菌使用TCBS、TSA液體培養基、固體培養基。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離 日本沼蝦取肝胰腺，研磨勻漿，稀釋10倍后取50 μL涂布于TCBS、TSA平板上，于30 ℃培養箱中培養16 h;水樣稀釋10倍后取 ? ? 100 μL涂布于TCBS、TSA平板上，于30 ℃培養箱中培養16 h。觀察平板上生長的菌落，根據菌落特征不同，分別挑取單個菌落接種于TSB試管中，30 ℃搖床培養18 h。

1.2.2 分離菌株的鑒定 按照細菌基因組DNA提取試劑盒提取純化菌株的DNA，將其作為模板進行PCR擴增。采用通用引物：27f：AGAGTTTGATCATGGCTCAG，1492r：GGTACCTTGTTACGACTT進行16S rDNA基因擴增，擴增體系50 μL：10×buffer ? ? ?5 μL，dNTPs 8 μL，1.5 mmol/L MgCl2 4 μL，PrimerF ?1 μL，PrimerR 1 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，模板DNA 2 μL，dd H2O 28.5 μL。

PCR反應條件：95 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s、55 ℃復性1 min、72 ℃延伸2 min，30個循環;72 ℃溫浴10 min。取5 μL PCR擴增產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，觀察結果。PCR擴增產物送蘇州金唯智生物科技有限公司進行序列測定。將序列與NCBI開放數據庫BLAST在線比對分析同源性，初步得出鑒定結果。

1.2.3 噬菌體抑菌效果試驗 分離得到的菌株采用TSB液培養基，30 ℃搖床培養18 h，通過分光光度計測OD值，將菌液調整成合適的濃度（OD600 nm 1.0左右）;取適量實驗室保存的噬菌體（NTHP01）液，離心取上清液，濾膜過濾。采用滴注法觀察噬菌體的噬菌效果。各取菌液100 μL均勻涂布于整個平板，待平板表面風干3～5 min后，再在平板上滴加5 μL噬菌體液，30 ℃培養8～12 h觀察噬菌效果。

1.2.4 噬菌體的示范應用 在浙江省德清縣下渚湖街道塘涇村一日本沼蝦養殖塘開展噬菌體制劑的示范應用。養殖塘面積約0.33 hm2，2018年7月5日放苗，放養密度為180萬尾/hm2，7月30日開始使用噬菌體制劑，以2%～3%添加在飼料中拌勻投喂，每天投喂1次，按照連續投喂3 d—停喂5 d—投喂3 d的規程進行預防，如發現病害則加大使用劑量和頻率;對照養殖塘不使用噬菌體制劑，傳統模式管理。10月初開始陸續捕獲商品蝦，統計養殖產量。

2 結果與分析

2.1 細菌的分離純化及鑒定結果

從日本沼蝦養殖塘的水樣中共分離到21個菌株（表1），經16S rDNA基因序列分析，結合菌落形態觀察，初步鑒定為芽孢桿菌屬、氣單胞菌屬、腸桿菌屬等;從日本沼蝦肝胰腺中共分離到20個菌株（表2），經16S rDNA基因序列分析，結合菌落形態觀察，初步鑒定為氣單胞菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌科等。

2.2 噬菌體對日本沼蝦養殖環境中常見細菌的噬菌作用

對從青蝦養殖塘水體和青蝦中分離到的41個菌株進行噬菌體噬菌試驗，結果表明噬菌體NTHP01對芽孢桿菌、氣單胞菌、不動桿菌、腸桿菌、檸檬酸桿菌、原生節桿菌、鄰單胞菌、格氏乳球菌等均具有較好的裂解作用（表1、表2）。

2.3 噬菌體的示范應用效果

在浙江省德清縣下渚湖街道塘涇村一日本沼蝦養殖塘開展噬菌體制劑的示范應用，經過一個養殖周期的應用，統計產量約為1 050 kg/hm2，產值12.00萬～15.00萬元/hm2;對照養殖塘由于發病等原因，產量很低，只有300～375 kg/hm2。與往年比較使用噬菌體的養殖塘產量至少增加338～412 kg/hm2，產值提高2.25萬～3.00萬元/hm2，且消毒劑和其他藥物的使用量大大減少，示范效果良好。

3 小結與討論

3.1 日本沼蝦養殖中常見的細菌性病害

日本沼蝦養殖中常見的細菌性疾病有紅體病、爛鰓病、弧菌病、黑斑病、軟殼癥等[2]。葉雪平等[3]從患紅體綜合征（紅體、紅頭）的青蝦肝胰腺和肌肉中分離到菌株，經生理生化分析、藥物敏感及感染試驗等，鑒定為擬態弧菌。沈錦玉等[4]、薛暉等[5]從患紅鰓病、紅體病青蝦的肝、肌肉、鰓中分離到菌株，均鑒定為嗜水氣單胞菌 。潘曉藝等[6]從患軟殼綜合征的瀕死青蝦體內分離到一株細菌，經API32E系統鑒定及16S rRNA序列分析， 確定該病原菌為維羅納氣單胞菌溫和生物變種，與維羅納氣單胞菌和維羅納氣單胞菌溫和生物變種的同源性都為99%。本研究采樣的日本沼蝦池塘雖然沒有發病，但從養殖水體、日本沼蝦體內均分離到大量菌株，經鑒定為氣單胞菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌科等，都是水產養殖中常見的致病菌，尤其氣單胞菌屬中的嗜水氣單胞菌在一定條件下可引起青蝦紅體病，該病傳染性強、發病面廣、死亡率高[2， 3， 5]，危害很大。

3.2 噬菌體對病原菌的抑制作用

噬菌體以細菌為宿主，可以特異性地殺滅相應的宿主菌，是一種天然的抗菌生物制劑，對革蘭氏陽性菌和陰性菌有裂解作用，特別對具有多重耐藥性的病原菌都有較好的裂解效果[7-9]。Karunasagar等[10]從牡蠣組織和蝦孵化場分離得到2個噬菌體，可以有效降低哈維氏菌群。Jun等[11]分離出2個噬菌體，發現對魚類致病性嗜水氣單胞菌均顯示出有效的溶菌活性。本研究將從日本沼蝦養殖塘水體和日本沼蝦中分離到的41個菌株進行噬菌體噬菌試驗，發現噬菌體NTHP01對芽孢桿菌、氣單胞菌、不動桿菌、腸桿菌、檸檬酸桿菌、原生節桿菌、鄰單胞菌、格氏乳球菌等均具有較好的裂解作用，農業部淡水漁業健康養殖重點實驗室曾于2019年對水產養殖中常見的致病菌進行體外噬菌試驗[12]，結果表明，噬菌體對嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、副溶血弧菌、維氏氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌等均有較好的裂解效果。

3.3 噬菌體在水產養殖中的運用

目前，噬菌體已成功應用于食源性致病微生物的防治，關于噬菌體在水產動物細菌性病害防控中的應用試驗，國外科學家開展的研究比較多，用于治療嗜水氣單胞菌引起的泥鰍出血性敗血病、哈維弧菌引起的斑節對蝦發光弧菌病、對蝦副溶血弧菌病、海參燦爛弧菌病等，均效果明顯[13-15]。Le等[16]分離獲得了2株嗜水氣單胞菌噬菌體，應用在嗜水氣單胞菌引起的條紋鯰大量死亡的有效性試驗中，該噬菌體的保護率可達到100%，對照組的存活率僅18.3%。本研究將噬菌體應用在日本沼蝦養殖中，按一定比例拌在飼料中定期投喂，初步的結果表明可降低日本沼蝦發病率，跟對照養殖塘相比產量提高338～412 kg/hm2，增加經濟效益2.25萬～3.00萬元/hm2。

綜上所述，噬菌體對日本沼蝦常見病害的病原菌具有較好的抑制作用，在實際生產中應用效果明顯。此外，噬菌體抑菌的作用機理是通過感染-繁殖-裂解循環周期殺滅細菌，與細菌是否耐藥無關，而且特異性強，除對宿主菌外的其他細菌無殺傷力，對機體的正常菌群基本無影響，對人體、動植物、環境無任何毒副作用。噬菌體制劑對今后發展成水產養殖中的抗生素替代制劑具有很好的應用前景。

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