全氟辛酸PFOA對斑馬魚生物毒性效應的影響研究

潘偉一,韓菊,沈洪艷

(1.河北科技大學 環境科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北省藥用分子化學重點實驗室，河北 石家莊 050018)

全氟辛酸(C8F17COOH，簡稱PFOA)是一種新型持久性有機污染物[1]。因其具有較強的化學穩定性、抗氧化性及疏水、疏脂等特性[2-3]，被廣泛應用于生產生活用品中[4-6]，易蓄積在環境水體中，在長江和黃河等水體中均有檢出[7-8]，因其具有難降解性、持久性、蓄積性及生物毒性[9-10]，已經在生態系統中廣泛傳播，并通過食物鏈蓄積在食肉動物和人體內[11]。因此，PFOA毒性效應已經成為當前研究的熱點問題，本研究以斑馬魚為受試生物，研究水體中PFOA對斑馬魚自由基(ROS)、超氧化歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乙酰膽堿酯酶(AchE)和乳酸脫氫酶(LDH)的影響，為PFOA對水生生物毒性提供毒理學數據。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

斑馬魚，購自某生物研究所；ROS，購自德國耶拿分析儀器股份公司；SOD、MDA檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；PFOA(純度為96%)、二甲基亞砜試劑(無水溶劑級)均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇為優級純；乙醇、冰醋酸均為分析純。

JJ323BC精密電子天平；2-16PK臺式高速冷凍離心機；Spectramax190酶標儀；photochem抗氧化劑自由基分析儀；Pipet-Lite和TopPette Pipettor移液槍；HH-4恒溫水浴鍋。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗生物培養 斑馬魚在充分曝氣的自來水中馴養15 d，以充分適應實驗室環境，馴養期間斑馬魚自然死亡率低于2%，并在實驗前24 h停止喂養。

1.2.2 毒性實驗 本研究為亞急性毒性實驗，為保證受試生物在實驗過程中不死亡，設置實驗最高暴露組濃度為96 h半數致死濃度的1/5，根據急性毒性實驗結果，PFOA 96 h LC50為661.695 mg/L，所以設置本實驗暴露組濃度分別為0,5,15,45,135 mg/L。每個暴露組設3組平行，重復3次實驗。實驗采用靜態實驗方法，實驗期間，在玻璃魚缸中分別加入4 L對應濃度的PFOA實驗液體，將馴養后的斑馬魚投放至各暴露組，每組25條，于暴露后的第3,6,9,12,15 d測定斑馬魚肌肉組織中組織蛋白含量、ROS含量、SOD活力、MDA含量、LDH活性，斑馬魚頭部AchE活性。

1.2.3 數據處理 本實驗數據采用Microsoft Excel 2010進行處理，實驗作圖使用Origin 8.6，使用GraphPad Prism 5、SPSS17.0對數據進行單因素方差分析和Tukey多重比較檢驗，p<0.05表示輕微顯著性差異，標記為*，p<0.01表示顯著性差異，標記為**，p<0.001表示極顯著性差異，標記為***。

2 結果與討論

2.1 PFOA對斑馬魚肌肉組織ROS含量的影響

圖1 各暴露組PFOA對斑馬魚肌肉組織ROS含量的影響Fig.1 Effects of PFOA in each exposed group on ROS content in zebrafish muscle tissue

由圖1可知，在整個實驗周期內溶劑對照組與空白組斑馬魚肌肉組織ROS含量無顯著差異，且趨于一致，由此判定助溶劑對斑馬魚肌肉組織毒性可忽略不計，不影響PFOS對ROS含量的毒性效應。暴露第3 d，各暴露組ROS含量均高于空白組，表明斑馬魚對PFOA有應激反應，除15 mg/L暴露組以外，其余5,45,135 mg/L暴露組ROS含量均顯著高于空白組(P<0.05)，且暴露濃度越高，產生的ROS值越高，其中135 mg/L暴露組ROS含量最高，為0.060 μmol/mL，這表明PFOA打破了斑馬魚細胞的動態平衡，迫使其產生ROS應對污染環境。暴露至第6 d時，各暴露組與空白組相比顯著性差異更明顯(P<0.01)，其中在5 mg/L暴露組中ROS含量比空白組高出0.013 μmol/mL，表明斑馬魚肌體持續受到PFOA脅迫后，斑馬魚機體內多余的ROS未被清除。暴露第12 d，斑馬魚肌肉組織中ROS顯著減少(P<0.01)，表明魚體內應脅迫產生的ROS已被SOD清除，但135 mg/L暴露組ROS含量仍高于空白組，直至暴露后第15 d 135 mg/L暴露組ROS含量與空白組才無顯著差異，表明在第15 d 135 mg/L暴露組斑馬魚體內應PFOA脅迫產生的ROS才被SOD清除，但ROS消除時間較5,15,45 mg/L暴露組延遲了3 d，表明高濃度的PFOA對斑馬魚ROS誘導作用更顯著，呈現明顯劑量-效應關系和時間-效應關系。Jia等[14]通過研究異煙肼對斑馬魚幼魚的毒性效應得出:異煙肼對斑馬魚ROS具有誘導作用，并引起斑馬魚肌體抗氧化能力下降，本研究斑馬魚肌肉組織內ROS含量在暴露9 d內顯著高于空白組，說明PFOA對斑馬魚ROS同樣具有誘導作用。

2.2 PFOA對斑馬魚肌肉組織SOD活力的影響

超氧化物歧化酶(SOD)是一種抗氧化酶，可以消除機體內ROS，保護機體免受損傷，對機體的氧化和抗氧化平衡起著至關重要的作用，是一類敏感的分子生態毒理學指標[15-16]。各暴露組PFOA對斑馬魚肌肉組織SOD活力的影響見圖2。

圖2 各暴露組PFOA對斑馬魚肌肉組織SOD活力的影響Fig.2 Effects of PFOA in each exposed group on SOD activity in zebrafish muscle tissue

由圖2可知，在暴露第3 d，與空白組相比暴露于5 mg/L PFOA的斑馬魚SOD活力出現輕微顯著差異(P<0.05)，135 mg/L暴露組出現了顯著差異(P<0.01)，但PFOA對斑馬魚SOD活力均表現為抑制作用。暴露第6 d，15 mg/L暴露組出現了極顯著差異(P<0.001)，各暴露組斑馬魚機體內SOD活力均低于空白組，且隨著暴露組濃度的升高，SOD活力顯著降低(P<0.01)，表明魚體受到PFOA脅迫后，產生ROS(見圖1)，SOD為消除ROS大量減少，表現為抑制作用，與ROS含量變化相比較，魚體內SOD活力與ROS含量變化呈現“相反”趨勢。暴露9 d后，5,15,45 mg/L暴露組SOD活力均高于空白組，且達到本次實驗最高值，分別為54.782，44.692，51.387 U/mgprot，表明肌體為了消除PFOA對肌體造成的氧化損傷產生大量SOD用于消除ROS。此時，PFOA對SOD表現為誘導作用，但135 mg/L暴露組SOD活力低于空白組，PFOA對SOD表現為抑制作用。暴露第12～15 d，5,15,45 mg/L暴露組SOD活力與空白組無顯著差異，這表明魚體抗氧化系統與外界脅迫達到了平衡，由圖2可知，此時ROS含量也顯著降低，并恢復至空白組水平，表明魚體已經消除了PFOA對肌體的不利影響。但135 mg/L暴露組SOD仍顯著低于空白組(P<0.01)，此時ROS含量已經恢復至空白組水平，表明為消除ROS消耗了大量SOD，也可能是隨著暴露時間的延長，PFOA濃度的升高，SOD的合成受到一定影響，所以135 mg/L的PFOA對斑馬魚SOD活性有抑制作用。高問等[17]通過土霉素廢水對斑馬魚的生物毒性效應研究也發現，隨著暴露時間的延長低濃度的土霉素廢水可引起斑馬魚氧化應激反應，導致SOD被誘導，而高濃度土霉素廢水可以抑制SOD的合成，與本文研究結果一致。

2.3 PFOA對斑馬魚肌肉組織MDA活力的影響

丙二醛(MDA)是一種脂質過氧化物，可以反映細胞損傷的程度，其含量越高，機體脂質過氧化損傷越嚴重[18-19]。MDA含量與ROS含量在一定程度上具有一定的正相關性，與SOD活力在一定程度上有一定的負相關性。各暴露組PFOA對斑馬魚肌肉組織MDA含量的影響見圖3。

圖3 各暴露組PFOA對斑馬魚肌肉組織MDA活力的影響Fig.3 Effects of PFOA in each exposed group on MDA content in zebrafish muscle tissue

由圖3可知，斑馬魚暴露于PFOA后第3～9 d，各暴露組MDA含量均顯著高于空白組，其中15,135 mg/L差異極顯著(P<0.001)，表明PFOA誘導魚體產生了ROS，未被SOD消除的ROS攻擊了生物膜中的不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化作用，產生大量MDA。其中45 mg/L暴露組MDA含量在第6 d達到本次實驗峰值5.08 nmol/mgprot。當暴露時間延長至第12 d，除15 mg/L暴露組外，其余各暴露組MDA含量均顯著低于空白組(P<0.01)，同時，各暴露組斑馬魚體內ROS含量顯著低于空白組，SOD活力與空白組均無顯著差異，表明魚體內ROS已經被消除，因此斑馬魚體內不產生MDA。暴露第15 d，各暴露組MDA含量與空白組均無顯著差異，各暴露組MDA的含量恢復到正常水平，與ROS含量變化相一致，表明機體已經適應了PFOA造成的氧化損傷。王奇等[20]通過研究磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶和磺胺甲基異惡唑三種典型磺胺類抗生素對羅非魚肝臟組織中丙二醛含量的影響發現，MDA含量在暴露前期達到最大，隨著暴露時間的延長逐漸減小，最終MDA含量降低到基本與空白組相當，與本研究MDA變化趨勢一致。

2.4 PFOA對斑馬魚頭部AchE活性的影響

乙酰膽堿酯酶(AchE)是一種與生物神經傳導有關的酶，是反映水生生物受到外界脅迫危害程度的毒理學指標之一[21]，AchE廣泛存在于各種動物組織中，在神經突觸間隙中，通過催化水解神經遞質乙酰膽堿來終止其對膽堿受體的興奮作用，維持神經沖動的正常傳遞，其活性升高則會抑制興奮的傳遞，活性降低則表現為過度興奮，無論其活性升高或者降低都會影響斑馬魚正常的生理生化功能[22-23]。各暴露組PFOA對斑馬魚頭部AchE活性的影響見圖4。

圖4 各暴露組PFOA對斑馬魚頭部AchE活力的影響Fig.4 Effects of PFOA in each exposed group on AchE activity in zebrafish head

由圖4可知，隨著暴露時間的增長，PFOA對斑馬魚頭部AchE活性表現為先誘導后抑制，斑馬魚暴露于PFOA后到實驗第9 d，各濃度組斑馬魚頭部AchE活力均隨著暴露時間的增長而增加，PFOA對AchE活性表現為誘導作用。其中，5 mg/L暴露組在第3 d和第6 d顯著高于空白組(P<0.05)；但暴露的第12 d，5，15 mg/L濃度組斑馬魚頭部AchE活性高于對照組，但45，135 mg/L濃度組AchE活性顯著低于空白組(P<0.01)，即低濃度的PFOA促進了AchE活性，高濃度的PFOA抑制了AchE活性。暴露至第15 d，5，15，45 mg/L濃度組與空白組相比AchE活性受到顯著抑制(P<0.01)，分析原因，PFOA具有神經毒性，對斑馬魚神經系統有破壞作用，導致神經突觸間隙中乙酰膽堿數量減少，從而抑制了興奮的傳遞。但到第12 d以后，濃度大于45 mg/L的PFOA抑制AchE活力，AchE活力降低，這可能是高濃度的PFOA破壞了神經遞質的傳導，表現出明顯的時間-劑量關系。Guo等[24]通過研究全氟化合物對斑馬魚的神經毒性效應發現，PFDoA破壞神經遞質系統(包括膽堿能和多巴胺信號系統)、抑制神經元發育，與本文中PFOA通過誘導AchE活性，間接影響神經遞質乙酰膽堿的數量，破壞神經遞質系統結論相一致。

3 結論

(1)本研究發現PFOA可以引起斑馬魚產生氧化應激反應，并呈現出時間-效應關系和劑量-效應關系。暴露期間ROS與MDA含量變化呈現正相關性，但ROS、MDA含量變化與SOD活力變化呈現“相反”趨勢。

(2)PFOA對斑馬魚體ROS具有誘導作用，且高濃度的PFOA對斑馬魚ROS誘導作用更顯著。MDA含量在暴露第6 d達到最大，并隨著暴露時間的延長逐漸減小，最終MDA含量降低到基本與空白組水平相當，該變化與ROS變化相一致，充分證明ROS與MDA含量變化呈現正相關性。

(3)在暴露前9 d，PFOA對斑馬魚體內SOD活力表現為先抑制后誘導的作用，魚體內SOD活力與ROS與MDA含量呈現負相關性。但暴露至12 d以后，低濃度暴露組斑馬魚SOD活力可恢復至空白組水平，高濃度暴露組SOD活力仍受到顯著抑制。

(4)PFOA具有神經毒性，通過誘導AchE活性，使斑馬魚神經突觸間隙中乙酰膽堿數量減少，從而抑制興奮的傳遞。在整個暴露周期內，隨著暴露時間的增長，PFOA對斑馬魚頭部AchE活性表現為先誘導后抑制。