恒河猴肺中陰溝腸桿菌的分離鑒定及藥物敏感性分析

李艷艷,禹文海,楊鳳梅,劉 權,陳麗雄,王俊斌,馬 進,徐鴻界,楊亞平,趙 遠,和占龍

(中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院 醫(yī)學生物學研究所,云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室,昆明 650118)

陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)在自然界中廣泛存在,在人和動物的糞便、水、泥土、植物中都可檢出。 該菌為條件性致病菌,特定條件下能感染呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等多個器官系統(tǒng),同時也可感染創(chuàng)口,嚴重時引發(fā)敗血癥等[1]。 老年人和抵抗力降低的病人是該菌的易感人群。 該菌也可導致兒童腦膜炎、腦梗塞、腦膿腫和腦囊腫等疾病, 甚至引起死亡。 因此,陰溝腸桿菌已成為引起醫(yī)院內感染的一種重要的病原菌。 另外,陰溝腸桿菌B29 是國際上公認的“肥胖細菌”,它是造成肥胖的直接元兇之一[2]。 大量研究報道,由于抗生素類藥物的不合理使用,使陰溝腸桿菌對多種抗菌藥物具有較高的耐藥性[3-4],陰溝腸桿菌普遍對第一代至第四代頭孢類、青霉素類等藥物有90%以上的耐藥率,這為臨床用藥的選擇帶來很大困難。 經(jīng)過多年對恒河猴的飼養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn),恒河猴呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病率高,嚴重時可引起死亡。 本文首次在恒河猴的肺組織中分離到陰溝腸桿菌,通過藥物敏感性試驗,確定治療陰溝腸桿菌的首選藥物,為今后的臨床治療工作提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級雄性恒河猴1 只,8 歲,體重約7 kg。 健康KM 小鼠10 只,雌性,6 ～8 周齡。 恒河猴及KM小鼠均來源于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所醫(yī)學靈長類研究中心(恒河猴生產(chǎn)許可證號[SCXK(滇) K2015-0004],使用許可證號[SYXK (滇)K2015-0006];KM 小鼠生產(chǎn)許可證號[SCXK (滇)K2014-0002],使用許可證號[SYXK (滇) K2014-0007])。 實驗內容經(jīng)本單位動物實驗倫理審查委員會審查通過(批準號:DWSP201902034),實驗過程按實驗動物使用的3R 原則給予實驗動物人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

SS 瓊脂(青島日水生物技術有限公司,批號20140522)、GN 增菌液(青島日水生物技術有限公司,批號20140215)、三糖鐵瓊脂(青島日水生物技術有限公司,批號20140331),ID 32 E 生化鑒定試條(梅里埃公司),藥敏紙片(北京天壇生物技術開發(fā)有限公司)。 電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司)、ATB Expression 儀(法國梅里埃公司)。

圖1 恒河猴病變Figure 1 The lesions of rhesus monkey

1.3 實驗方法

1.3.1 病例資料

該恒河猴身體健康,由人工飼養(yǎng),每日喂以基礎飼料[5],自由飲水。 每日清洗猴籠,定期消毒。通過日常飼養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)該恒河猴表現(xiàn)為呼吸困難,精神沉郁,厭食,活動減少等癥狀,立即轉入治療室單籠飼養(yǎng)及治療,靜脈輸液青霉素(80 萬單位/次)3 d 后病情好轉,停藥觀察,該猴精神及飲食情況并未完全恢復。 在治療室內隔離觀察20 d 后放回大籠飼養(yǎng),于放回大籠第2 天死亡。 尸檢外觀可見腹部鼓氣(見圖1A),解剖心臟、肝、脾、胰腺、腎、腎上腺、膀胱未見異常,胃、腸管內充氣(見圖1B),部分腸道呈出血性炎性變化,雙肺下呈充血、出血,邊緣部分肉樣肺炎病變(見圖1C)。

1.3.2 病料采集及培養(yǎng)

解剖柜條件下解剖死亡猴,用無菌手術剪切開肺組織,用滅菌接種環(huán)在肉眼病變明顯和正常肺組織部位采樣,接種于GN 增菌液,在恒溫培養(yǎng)箱(37℃)內增菌8 h 后,接種SS 瓊脂培養(yǎng)基,將平皿倒置放于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 ～24 h 后觀察結果。

1.3.3 細菌分離培養(yǎng)

挑選SS 瓊脂培養(yǎng)基上典型菌落穿刺接種于三糖鐵瓊脂鑒別培養(yǎng)基,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h,作進一步的分離培養(yǎng)和產(chǎn)酸產(chǎn)氣等培養(yǎng)特征的鑒定。 同時挑取單個菌落進行革蘭氏染色,鏡檢。

1.3.4 細菌生化鑒定

細菌生化鑒定采用法國生物梅里埃公司ATB細菌鑒定系統(tǒng)及配套ID 32E 鑒定卡。 按照說明書,在鑒定卡中加入樣品后放37℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng),18 ～24 h 內觀察生化反應結果。 將反應結果編號輸入ATB 鑒定系統(tǒng),判定結果。

1.3.5 藥敏試驗

用紙片擴散法,對分離到的細菌進行常用抗菌類藥物的敏感性試驗。 平皿置于37℃培養(yǎng)24 h 后取出,觀察并測量抑菌圈直徑大小(mm)。 結果判定按美國CLSI 的抗微生物藥物敏感性試驗操作方法和判斷標準進行[6]。 所用8 種藥敏試紙片如下表。

表1 藥敏紙片及規(guī)格Table 1 Specification of drug-sensitive paper

1.3.6 病理檢查

取肉眼見明顯病變部位,4%甲醛溶液固定后制作病理切片,HE 染色,鏡檢。

1.3.7 小鼠致病性試驗

用滅菌生理鹽水將分離純培養(yǎng)的細菌稀釋,ATB 比濁儀調整菌液濃度為4 McF。 設立實驗組和對照組,實驗組6 只小鼠,腹腔注射菌液0.5 mL/只,對照組4 只小鼠,腹腔注射滅菌生理鹽水0.5 mL/只。 記錄發(fā)病及致死情況,解剖死亡小鼠,記錄病理變化,無菌條件下采集肺臟組織進行細菌分離培養(yǎng)。

2 結果

2.1 菌落特性

細菌經(jīng)培養(yǎng)在SS 培養(yǎng)基上生長成濕潤、表面光滑、白色或乳白色、不透明的圓形菌落(如圖2A),革蘭氏染色鏡檢,可見革蘭氏陰性小桿菌(如圖2B)。

圖2 恒河猴肺組織分離菌菌落及菌體形態(tài)Figure 2 Colony and bacterial morphology from lung in rhesus monkey

2.2 生化特性

三糖鐵培養(yǎng)基分離培養(yǎng),該菌產(chǎn)酸產(chǎn)氣。 將ID 32E 鑒定卡反應結果編號輸入ATB 鑒定系統(tǒng),判定該細菌為陰溝腸桿菌, ID 為99.9%,T 為0.71,ID編碼35074753311,生化結果見表2。

2.3 藥物敏感性試驗

陰溝腸桿菌藥敏試驗測得的抑菌圈直徑大小見表3。 從表中可看出該菌對氨芐西林、頭孢呋辛中等敏感;對諾氟沙星、阿米卡星、慶大霉素、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢噻肟敏感。

2.4 病理結果

肺部病變明顯部位制作病理切片,鏡檢可見肺內炎性肉芽腫形成(圖3A),泡沫細胞聚集,血管支氣管周圍淋巴細胞浸潤(圖3B)。

表2 細菌生化特性檢測結果Table 2 Detection results of biochemical characteristics

2.5 小鼠致病性試驗

實驗組小鼠于接種菌液后5 h 出現(xiàn)活動減少、精神萎靡、閉目、呼吸急促等臨床表現(xiàn),19 h 內全部死亡,解剖可見肺葉出血、胃腸鼓氣、十二指腸腸壁變薄等病變(如圖4A、4B)。 取病變肺臟組織進行細菌培養(yǎng),分離出陰溝腸桿菌,表明該株陰溝腸桿菌對小鼠有較強的致病性。 對照組小鼠行為表現(xiàn)及剖檢情況均正常(如圖4C)。

3 討論

陰溝腸桿菌屬腸桿菌科腸桿菌屬,是條件致病菌,通常在人和動物的腸道內寄生。 如朱旗[7]等發(fā)現(xiàn)在賽馬腸道菌群中存在陰溝腸桿菌,黃小蘭[8]等從圈養(yǎng)滇金絲猴糞便中分離到陰溝腸桿菌。 近年來陰溝腸桿菌備受關注是因為其引發(fā)的呼吸系統(tǒng)感染疾病日益增多。 大量研究表明,某些嚴重的基礎疾病如燒傷、手術創(chuàng)傷、惡性腫瘤等,以及實施氣管切開、導尿、靜脈插管等侵入性診療操作,都能破壞機體免疫屏障結構,造成免疫功能降低;另外激素等免疫抑制劑、化療藥物、抗生素的大量應用及不適當?shù)穆?lián)合用藥抑制了正常菌群,使機體內的正常菌群大量減少,導致陰溝腸桿菌等條件致病菌增多并大量繁殖成為優(yōu)勢菌種[9],并定位移植到腸外的其他器官系統(tǒng),感染部位主要是下呼吸道和泌尿道[10]。 目前,對人類由陰溝腸桿菌引起的疾病研究較多,動物方面也較常見。 如陰溝腸桿菌引起呼吸系統(tǒng)疾病的報道,包扣大熊貓呼吸道、七彩山雞肺臟、亞洲黑熊肺臟、綿羊肺部、牛肺臟感染[11-13];另有陰溝腸桿菌引起孔雀胚死亡、羅氏沼蝦幼蝦死亡、與馬鏈球菌獸疫亞種混合感染引起的馬出血性敗血癥等報道。 但未見恒河猴感染的有關報道。本文中該恒河猴由治療室轉出后突然死亡,可能是由于治療室與飼養(yǎng)大籠溫差較大,且突然改變環(huán)境引起的。 病理變化主要為呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng),與由陰溝腸桿菌單獨感染引起的綿羊肺炎的病理變化,如肺尖葉、心葉、隔葉呈不同程度的出血、充血及肝變,消化道表現(xiàn)為輕重不同的卡他性和出血性炎癥變化基本一致[14]。 恒河猴腹瀉及肺炎是常見病與多發(fā)病,嚴重者導致死亡。 本文從死亡恒河猴肺中分離到陰溝腸桿菌,這可能與恒河猴腹瀉時抵抗力下降以及不適當?shù)氖褂脧V譜抗菌藥物,致使恒河猴體內菌群失調,導致陰溝腸桿菌從消化道移位到呼吸系統(tǒng)有關。 另外也可能與院內獲得性感染有關,隨著住院時間的延長,恒河猴與病原微生物接觸的機會增加,危重情況下更易感染陰溝腸桿菌。 因此入院后應隔離治療,避免交叉感染。

陰溝腸桿菌與銅綠假單胞菌、鮑曼氏不動桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌是引起下呼吸道感染的主要革蘭陰性腸桿菌。 陰溝腸桿菌的耐藥機制較為復雜,包括作用靶點的改變、主動外排活躍和外膜蛋白缺失、整合子、qnr 基因介導、產(chǎn)生β-內酰胺酶等,其中產(chǎn)超廣譜β-內酰胺酶是腸桿菌科細菌最主要的耐藥機制。 長期使用大量的抗菌藥物會引起細菌耐藥和交叉耐藥,造成臨床治療失敗,使臨床感染治療面臨潛在威脅[15-16]。 本研究中陰溝腸桿菌對8 種所試抗菌藥物均敏感,未出現(xiàn)耐藥的情況,這可能與治療時間較短有關系。 在我國獸醫(yī)臨床治療過程中,濫用抗菌藥物的現(xiàn)象極為普遍,僅憑經(jīng)驗長期大量的使用廣譜抗菌藥物會引起動物體內菌群失調,導致陰溝腸桿菌感染及耐藥性的產(chǎn)生。 因此在實際工作中,為了有效控制該菌所致的各種感染,要做到以下幾點:首先,采取有效的隔離措施,及時、正確治療嚴重的基礎疾病,做到早發(fā)現(xiàn)早隔離早治療;其次避免或縮短侵入性操作,降低陰溝腸桿菌侵入性感染的機率;同時加強抗菌藥物的流通管理工作,根據(jù)藥敏試驗選用抗菌藥物,合理使用抗生素和激素,減少陰溝腸桿菌耐藥性的產(chǎn)生;最后做到徹底消毒滅菌,避免陰溝腸桿菌的散播。

本研究中,從死亡恒河猴肺中分離到陰溝腸桿菌,該株陰溝腸桿菌對小鼠具有較強的致病性。 藥敏試驗結果表明陰溝腸桿菌對頭孢哌酮、頭孢噻肟最敏感,這為今后發(fā)現(xiàn)相同疾病的臨床治療工作提供一定的理論依據(jù)。

表3 陰溝腸桿菌藥敏試驗結果Table 3 Susceptibility test results of pneumonia pathogenic bacterium in rhesus monkey

圖3 恒河猴肺組織病理改變(HE 染色,× 100)Figure 3 Pathological changes of lung in rhesus monkey. HE staining

圖4 小鼠病變Figure 4 The lesions of mice