大鼠心肌缺血再灌注損傷模型建立的改良方法

王平安,楊珂偉,王 靜,焦 成

(武漢華聯科生物技術有限公司,武漢 430206)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)嚴重危害著全球人類的健康,成為主要死亡原因之一[1]。 目前,人們公認的對AMI 最有效的治療方法是冠狀動脈再灌注,但也伴隨著再灌注損傷的問題[2]。 對于心肌缺血再灌注損傷的研究成為了全球的熱點問題之一。 大鼠心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)造模后大鼠的成活率及造模成功率是制約模擬臨床心血管、藥理藥效等方面研究的關鍵因素之一,但構建一套標準的、可持續操作的心肌缺血模型的制約因素卻有很多[3-4]。 快速操作法和常規開胸法是MIRI 造模的兩種常用方法,但存在開胸時間短對實驗操作技術要求高、術中出血、氣胸等因素導致模型成功率低下,因此,本研究對MIRI 造模進行改良優化,并與這兩種常用的方法進行比較,從模型構建成功率、大鼠存活率和心肌缺血損傷等方面探討改良式造模操作的可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠45 只,8 周齡,體重280 ～300 g,由華中農業大學動物實驗中心提供[SCXK(鄂) 2015-0018]。 本次研究實驗動物的飼養、建模等均在SPF 級屏障環境動物房實驗操作間進行[SYXK (鄂) 2018-0104],實驗動物的使用遵循了3R 原則。 所有實驗操作均獲得武漢華聯科生物技術有限公司實驗動物福利倫理委員會的審批(批準號:HLK-20190218-01)。

1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉購自美國Sigma 公司;TTC 染色劑、伊文思藍染液均購自武漢華聯科生物技術有限公司。 呼吸機購自北京北瑞未來分析儀器有限公司;體視顯微鏡購自舜宇光學科技;心電圖機購自廣州市三銳電子科技有限公司;數碼相機購自日本Nikon 公司;小動物撐開器購自海德創業(北京)生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及模型構建

45 只SD 大鼠隨機分為3 組:快速操作組、常規開胸組、改良組,每組15 只。 大鼠適應性飼養1 周,自由進食,晝夜均衡,溫度23℃～26℃,濕度(50±5)%,術前12 h 禁食不禁水。

快速操作組:依據文獻報道[5],采用不使用呼吸機快速造模方式進行造模。 3%的戊巴比妥鈉腹腔注射劑量1.5 mL/kg 腹腔注射[6],止血鉗快速分開3～4 肋間,擠出心臟快速結扎送回胸腔。 用止血鉗把皮膚夾住閉胸后觀察心電圖變化,成功標準T波高聳或倒置,缺血30 min 后松開止血鉗,抽出扎線再灌注。 快速縫合胸腔及皮膚。

常規開胸組:依據文獻報道[7],采用開胸造模方式進行造模。 大鼠麻醉后接呼吸機,常規開口剪斷2 根肋骨,打開胸腔充分暴露心臟后行結扎,在左心耳下方3～4 mm 處左冠狀動脈與后降支分叉處用現代標準代碼5-0 無創傷絲線穿過左冠脈降支,進針深度0.2～0.4 mm,結扎后30 min 后再灌注,閉胸縫合。

改良組:3%的戊巴比妥鈉腹腔注射劑量1.5 mL/kg 腹腔注射,頸部及胸腔毛發剪除消毒,頸部中間開口1 cm,胸骨舌骨肌止血鉗鈍性分離暴露氣管,顯微剪刀切開小口,開口不宜過大,插入呼吸機插管,呼吸機參數:(呼吸頻率:90 次/min;呼吸比:1∶2;朝氣量:11 cc)生理鹽水棉球蓋住創口。 于第3、4 肋骨間(可手按胸腔感知心臟跳動最明顯位置)皮膚開口1 cm,下行處有一條小靜脈可兩端止血鉗夾住10 s,剪刀剪斷,肋間開小口0.5 cm(圖1a)。 2 個撐開器上下左右以肋骨配合撐開,可見心臟,止血鉗挑開心包膜,再夾住胸腺部位固定,另一只手持針(5-0 縫合線,3×8 圓針)左心耳下方3 mm 處進針(圖1b)。 深度1 mm,寬度2 mm(圖1c)扎針進線后在上方放一根線徑0.53 mm,長5 cm 魚線,活結結扎(圖1 d 和圖1e)。 縫合閉胸,30 min 后輕抽魚線再灌注(圖1f)。 以上3 組術后給予80 萬青霉素0.5 mL/只抗炎。 分別于實驗后24 h 和1 周取材心臟。

1.3.2 觀測指標

通過測量Ⅱ導聯心電圖同步監測大鼠結扎30 min 后的心電圖表現,并與術前標準的Ⅱ導聯心電圖比較,觀察大鼠心電圖有無再灌注心律失常現象。

1.3.3 心臟TTC+伊文思藍染色

缺血再灌注24 h 和1 周結束后,右側頸內靜脈內注入1%伊文思藍1 mL。 待鼠口唇藍染后,取下心臟,剔除心房心耳,-20℃速凍約20 min,便于切片。 平行房室溝將左室切成1.5 ～2 mm 厚的切片。切片入TTC 染液(2%)避光浸染,30℃避光孵育15～30 min,邊孵育邊觀察樣本顏色變化。 切片入10%中性福爾馬林中固定24 h。 吸干組織表面液體,并將組織表面多余的染色液沖洗掉,此時可肉眼觀察并立即拍照。

1.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS 22.0 進行統計學分析,計量資料采以平均數±標準差( ˉx ±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

圖1 大鼠MIRI 造模改良方法Figure 1 An improved method for establishing a rat model of MIRI

圖2 結扎前后大鼠心電圖變化Figure 2 Changes of electrocardiogram in rats before and after ligation

2 結果

2.1 造模成功心電圖表現

大鼠結扎后心電圖ST 段出現抬高,表現出心律失常現象,提示心肌缺血再灌注大鼠模型構建成功,見圖2。

2.2 模型存活率和成功率比較

記錄三組大鼠的存活和造模成功情況,比較各組間的存活率和造模成功率:快速操作組7 只大鼠死亡,存活率為53.33%,3 只造模失敗,造模成功率為33.33%;常規開胸組5 只大鼠死亡,存活率為66.67%,2 只造模失敗,造模成功率為53.33%;改良組2 只大鼠死亡,存活率和造模成功率均為86.67%。

2.3 MIRI 大鼠心肌損傷的病理情況比較

采用TTC+伊文思藍染色對三種方式造模24 h及1 周后各組大鼠心肌缺血、梗死面積進行觀察。如圖3 所示,造模24 h 及1 周后,快速操作組大鼠受手術視野結扎位置所限,缺血梗死面積不統一,快速操作組大鼠受灌注材料方法不同的影響,缺血梗死面積厚度不統一,而改良組大鼠由于手術視野開闊,結扎位置統一,缺血梗死面積較為統一。

圖3 TTC+伊文思藍染色觀察造模后大鼠心肌缺血、梗死面積Figure 3 Observation of myocardial ischemia and infarct size in rats by TTC+Evans blue staining

3 討論

AMI 在發達國家有著“頭號殺手”的稱號,而隨著我國經濟的快速發展以及生活方式的西化,使得我國AMI 的發病率和死亡率呈現出逐年遞增的趨勢[8]。 當心肌缺血時,其代謝模式和超微結構均發生變化,恢復缺血部分的血流量是常用的治療策略,然而,當血流量恢復時則易導致MIRI 的發生[9]。 MIRI 的概念是由Jennings 等[10]根據組織細胞缺血后獲得血液再灌注時,組織細胞缺血所造成的損傷并未得到減輕和恢復,反而加重的病理變化而首次提出的。 MIRI 動物模型的成功建立可為MIRI 的臨床治療以及藥物開發提供實驗基礎,MIRI動物模型的構建研究具有重大的意義,其構建方法多樣,但也存在著相應的局限性。

快速操作法及常規開胸造模是目前廣泛應用于心肌缺血再灌注模型的造模方法,具有操作較快、方便、視野開闊等優點,但由于快速操作法對于單人手術操作而言要求較高,胸腔外擠出心臟快速結扎時需快速操作,在開胸后2 min 內完成擠出心臟、穿線等過程,且缺血時閉胸難度大,較難將胸腔完全封閉,易氣胸導致大鼠死亡。 在實際操作過程中難度較大,不用呼吸機協助死亡率較高。 而常規開胸法因剪斷肋骨開口不整齊,在術后的縫合難度大,縫合線稍緊胸腔坍塌壓迫肺呼吸,導致呼吸困難,易氣胸,且缺血梗死面積較不一致,為后續的指導臨床研究、藥效評價、細胞治療等研究帶來諸多不利因素。 因此,需要尋找一個快速、高成功率、低死亡率的造模方法。

用于構建MIRI 模型的實驗動物種類較多,根據接近人體病理生理的原則對實驗動物進行選擇,在進化關系上接近人類,基因背景清楚、繁殖周期短、模型重復率高的大鼠在模型制備上具有一定的優勢[11]。 本次研究選擇SD 大鼠作為MIRI 模型構建的實驗動物,在以往造模方法的操作上進行改良,并與上述兩種常用方法進行比較。 相較于傳統方法,經改良后的再灌注在出血量、創傷、呼吸順暢、手術視野、操作難度等方面均有較大改善。 因開口由二個撐開器配合撐開胸腔,動靜脈小血管沒有被切斷,出血量微乎其微,墊魚線縮短了再灌注時的解線再縫合時間,避免二次麻醉導致大鼠生理機能受損,達到了術后最好狀態。 閉胸縫合后胸腔完整度很好,避免出現死腔空腔保證了成功率及成活率,在缺血梗死面積及位置也較為統一。

綜上所述,本實驗主要對大鼠心肌缺血再灌注模型制備過程中進行改進,與快速操作組和常規開胸組相比,具有更高的造模存活率及成功率,對后期心肌缺血再灌注的模型構建具有重要的指導意義。