基因芯片法在結核分枝桿菌耐藥基因快速診斷中的應用價值

楊映暉 伍定輝 蘇偉明 董春萍 姚向陽

隨著對結核分枝桿菌耐藥分子機制研究的深入，多種結核分枝桿菌耐藥基因的檢測方法相繼出現。基因芯片法是近年來在醫療領域最具影響力的科技發展成果之一，可快速檢測臨床疑似標本中的分枝桿菌屬DNA。本研究采用前瞻性的方法，通過對患者同一份痰標本同時進行基因芯片法、GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)和BACTEC MGIT 960液體培養及其比例法藥物敏感性試驗(簡稱“MGIT 960培養及其比例法藥敏試驗”)3種方法進行結核分枝桿菌及其耐藥基因rpoB、katG及inhA的檢測，并對3種檢驗結果進行對比分析，探討基因芯片檢測技術的優勢和不足。

資料和方法

一、資料收集

采用前瞻性的方法，收集2017年6月至2018年6月廈門大學附屬第一醫院肺科門診及住院的疑似肺結核患者的痰標本。標本采用患者晨痰，同一份痰標本同時進行基因芯片法、GeneXpert法和MGIT 960培養及其比例法藥敏試驗3種方法進行檢測。肺結核診斷標準參照《WS 288—2017 肺結核診斷》[1]。本研究收集933例患者的晨痰標本；其中，男674例，女259例；年齡11～84歲，中位年齡56歲。

二、儀器與試劑

分枝桿菌菌種鑒定芯片(成都博奧晶芯生物科技有限公司；產品貨號301030)；結核分枝桿菌耐藥基因檢測芯片(成都博奧晶芯生物科技有限公司；產品貨號301035)；Extractor 36核酸快速提取儀(博奧生物集團有限公司)；LuxScan 10K-B微陣列芯片掃描儀及配套儀器(博奧生物集團有限公司)；GeneXpert MTB/RIF檢測儀(美國Cepheid 公司)；結核分枝桿菌rpoB基因和突變檢測試劑盒(Cepheid AB 瑞典賽沛公司；產品貨號1000061494)；BACTEC MGIT 960全自動培養儀(美國BD公司)；分枝桿菌藥物敏感性羅氏培養基(珠海貝索生物技術有限公司)。

三、菌種及耐藥基因檢測

(一)基因芯片法檢測

1.標本制備及核酸提取：痰標本加入等量10% NaOH溶液，振蕩液化15～20 min，以3035×g離心5 min，離心后棄上清。再加入1 ml生理鹽水，充分振蕩后以12 830×g離心5 min，離心后棄上清。向核酸提取管中加入80 μl核酸提取液，加入上述標本后，使用Extractor 36核酸快速提取儀振蕩5 min，95 ℃水浴5 min，再以8910×g離心1 min。

2.PCR擴增：采用不對稱擴增法對相關基因位點進行擴增。分別采用PCR擴增試劑1、2、3對每份樣品進行3管PCR擴增反應。分別向3管中加入2 μl模板DNA和18 μl PCR擴增試劑。每管PCR反應體系總體積為20 μl，置于PCR擴增儀中進行擴增。PCR反應條件為：37 ℃激活10 min；94 ℃變性600 s；94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，35個循環；94 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，10個循環；72 ℃ 420 s。

3.芯片雜交與結果判讀：擴增反應完成后，在利福平芯片雜交管中加入3 μl擴增產物1、3 μl擴增產物2和9 μl雜交緩沖液，在異煙肼芯片雜交管加入3 μl擴增產物1、3 μl擴增產物3和9 μl雜交緩沖液。15 μl雜交反應混合物于95 ℃變性5 min，后立即冰水浴3 min。吸出13.5 μl雜交反應混合物加入芯片陣列，再置于50 ℃雜交儀中雜交120 min。雜交后經洗滌甩干后使用LuxScan10K-B微陣列芯片掃描儀和晶芯軟件進行信號的讀取及結果的判讀。

(二)MGIT 960培養及其藥敏試驗

取4倍體積的4% NaOH溶液溶于痰標本中，旋渦振蕩混勻，使痰標本充分液化，靜置15 min，以3035×g離心5 min，棄上清后中和，用一次性無菌吸管吸取處理后的痰標本0.5 ml，接種于液體培養管中，加載到BACTEC MGIT 960全自動培養儀上。培養陽性后，通過萋尼抗酸染色確定是否培養出抗酸桿菌；取陽性菌株接種于羅氏培養基進行傳代，并接種噻吩-2-羧酸肼和對硝基苯甲酸鑒別培養基，鑒定是否為結核分枝桿菌。比例法藥敏試驗：挑取對數生長期的結核分枝桿菌菌落，用滅菌生理鹽水配制1麥氏濁度的菌懸液，然后使用無菌的10 μl標準接種環，進行100倍和10 000倍稀釋，用10 μl無菌標準接種環分別挑取10 000倍稀釋菌懸液一環，劃線接種于一組空白對照培養基和含藥培養基，再用10 μl無菌標準接種環分別挑取100倍稀釋菌懸液一環，劃線接種于另外一組空白對照培養基和含藥培養基，擰緊培養基管蓋，豎直置于恒溫培養箱中，于37 ℃培養4周后觀察記錄藥敏試驗結果。

(三)GeneXpert檢測

將痰標本與消化液以1∶2的比例加入15 ml無菌干燥離心管中，振蕩，室溫靜置15 min，使痰標本充分液化。使用與GeneXpert MTB/RIF樣品盒配套的一次性移液管，將2 ml處理后的樣品加至樣品盒中，將樣品盒掃描二維碼，錄入信息，放入GeneXpert MTB/RIF儀器中，2 h后讀取記錄檢測結果。

四、質量控制

所有參加本研究的工作人員均接受嚴格、系統的培訓并掌握實施方案，嚴格按照標準納入患者，完成各項操作，進行結果判斷。實驗過程均做陰性、陽性質量控制。

五、統計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。計數資料以“率(%)”描述，采用χ2檢驗進行比較，以P<0.05為差異有統計學意義。一致性檢驗采用Kappa檢驗，Kappa值≥0.75為兩者一致性較好，0.4≤Kappa值<0.75為兩者一致性一般，Kappa值<0.4為兩者一致性較差。各百分率的95%CI采用OpenEpi 3.01軟件進行計算。

結 果

一、基因芯片法檢測結核分枝桿菌對異煙肼耐藥的效能

933例患者的痰標本中，基因芯片法檢測出陽性484例，GeneXpert檢測出陽性462例，MGIT 960培養出陽性411例。3種檢測方法均為陽性的標本有395例，從3種檢測結果均為陽性的標本中通過Excel表以完全隨機的方式抽取232份分別進行異煙肼耐藥基因katG及inhA檢測。以MGIT 960培養及其藥敏試驗結果為參考標準，基因芯片法檢測出異煙肼耐藥的敏感度為86.67%(26/30)，特異度為96.53%(195/202)，一致性達95.26%(221/232)，Kappa值為0.798(0.682～0.914)，具有良好的一致性(表1)。

二、基因芯片法和GeneXpert檢測結核分枝桿菌對利福平耐藥的效能

分別采用基因芯片法和GeneXpert進行利福平耐藥基因rpoB檢測，同樣以MGIT 960培養及其藥敏試驗結果為參考標準，基因芯片法檢測出的利福平耐藥敏感度為93.75%(30/32)，特異度為97.00%(194/200)，一致性達96.55%(224/232)，Kappa值為0.862(0.768～0.956)，兩者具有良好的一致性(表2)。

以MGIT 960培養及其藥敏試驗結果為參考標準，GeneXpert檢測出的利福平耐藥敏感度為84.38%(27/32)，特異度為97.00%(194/200)，一致性達95.26%(221/232)，Kappa值為0.803(0.691～0.915)，兩者具有良好的一致性(表2)。

表1 以MGIT 960培養及其藥敏試驗結果為參考標準判斷基因芯片法檢測異煙肼耐藥性的效能

表2 以MGIT 960培養及其藥敏試驗結果為參考標準判斷基因芯片法與GeneXpert檢測利福平耐藥性的效能

表3 以MGIT 960培養及其藥敏試驗結果為參考標準判斷基因芯片法與GeneXpert檢測利福平耐藥一致性的比較

將基因芯片法與GeneXpert進行比較，結果顯示兩種方法檢測出的利福平耐藥陽性一致性為90.91%(30/33)，陰性一致性為96.98%(193/199)，總一致性達96.12%(223/232)，Kappa值為0.847(0.749～0.945)，具有良好的一致性(表3)。

討 論

耐藥結核病是重大的公共衛生問題，為控制結核病的一大障礙[2]。盡早掌握結核分枝桿菌耐藥狀況及影響因素，可提高耐藥結核病的發現和治療能力[3]，對減少耐多藥結核病的傳播具有重大意義[4]。因此，臨床實驗室迫切需要開發特異度和敏感度高、檢測速度快的檢測方法。

目前，最普遍使用并被視為診斷結核病參考標準的MGIT 960培養及其藥敏試驗，存在操作繁瑣、陽性率低、耗費時間長和生物安全性差等問題，明顯滯后于結核病早期診斷的期望[5]，無法滿足臨床快速診斷的需求。近幾年，隨著分子生物學和基因工程技術的發展，分子診斷技術成為結核病快速診斷的主要手段[6]。其中基因芯片技術敏感、準確且簡便可靠，可以同時檢測到多種靶基因，如異煙肼耐藥基因katG和inhA基因啟動子及利福平耐藥基因rpoB等常見突變位點。該檢測手段所需樣本量少、準確、信噪比極小且易于操作，開辟了新的臨床診斷視野。

本研究將基因芯片法與GeneXpert和MGIT 960培養及其藥敏試驗進行了深入比較，在結核分枝桿菌快速檢測及結核分枝桿菌耐藥檢測方面具有良好的敏感度和特異度。基因芯片法結果與傳統細菌學培養和藥敏試驗結果具有良好的一致性，并且彌補了后者耗時長、陽性率低、占用實驗室空間的缺陷；與GeneXpert方法比較，兩種方法檢測結果差異無統計學意義，但GeneXpert只能檢測一種耐藥基因(rpoB)，基因芯片技術能一次檢測katG、inhA和rpoB3種耐藥基因，對耐多藥結核病的快速診療更有應用價值。代小偉等[7]、許榕青等[8]和王小路等[9]的研究結果也均顯示基因芯片技術在結核分枝桿菌及耐藥基因檢測中具有明顯優勢，與本研究所獲得的結果基本一致。

但是，每種方法都有各自的局限性，與其設計原理、操作復雜性及結果判讀偏倚等有關。本研究發現，基因芯片法和GeneXpert在結核分枝桿菌檢測的陽性例數方面，與MGIT 960培養及其藥敏試驗方法存在部分差異。分析可能的原因是：結核分枝桿菌的檢出結果受多種因素限制，如細菌代謝及繁殖是否旺盛，是否處于休眠狀態，是否存在形態多樣性等因素[10]。結核分枝桿菌處于休眠或者衰亡狀態，就可能出現培養陰性的情況。同時也突顯出當今分子診斷技術普遍存在的不足之處，即不能判斷結核分枝桿菌是否是具備傳染性的活菌，不能準確評價所用藥品的療效。所以基因芯片法不能完全取代MGIT 960培養及其藥敏試驗方法，兩者可以互相補充。

綜上所述，基因芯片法在結核分枝桿菌及耐藥基因的檢測中，具有較高的敏感度和特異度，且檢測時間短，與傳統方法相比，具有快速、安全、準確、有效的特點，有利于耐多藥結核病的早期診斷及防控，值得在臨床診療中推廣應用。