miRNA-320a、hTcf-4、β-catenin在肝癌組織的表達及臨床意義

祁蕙燕 郭劍 程燕莉

既往資料顯示，肝癌患者分化程度、腫瘤T分期等臨床病理資料與患者的預(yù)后密切相關(guān)，但影響患者病理特征、預(yù)后的機制尚未完全闡明［1］。微小RNA（MicroRNA，miRNA-320a）位于染色體8q21.3，與前列腺癌發(fā)生與復(fù)發(fā)息息相關(guān)，提示miRNA-320a 可能與惡性腫瘤有關(guān)，但在肝癌領(lǐng)域的研究較少［2］。β 聯(lián)蛋白（β-catenin）、人T 細胞因子4 基因（Human T cell factor 4 gene，hTcf-4）是Wnt/β-catenin 信號通路重要因子，其中β-catenin 與前列腺癌放療抵抗相關(guān)，hTcf-4在膠質(zhì)瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演重要角色［3-4］。鑒于此本研究探討肝癌組織miRNA-320a、hTcf-4、β-catenin 表達及與患者病理特征、預(yù)后的關(guān)系，報告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2017年6月至2019年8月本院收治的122 例肝癌患者進行回顧性研究，其中女65 例，男57 例，年齡41～75 歲，平均（55.97±7.36）歲。納入標準：①符合原發(fā)性肝癌診斷標準［5］；②臨床資料完整；③首次明確診斷；④無其他系統(tǒng)原發(fā)性惡性腫瘤；⑤入組前無放化療等相關(guān)治療史。排除標準：①肝癌復(fù)發(fā)患者；②以往有惡性腫瘤史者。本研究獲本院倫理委員會審核通過，患者均知曉本研究，自愿簽署知情同意書。

1.2 方法

采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）檢測肝癌組織與癌旁組織miRNA-320a、hTcf-4mRNA 表達，以2-△△Ct進行分析；采用免疫組化二步法檢測β-catenin 表達，根據(jù)胞質(zhì)染色強度和陽性細胞數(shù)進行評分。

結(jié)果判讀［6］：陽性細胞數(shù)11%～50%為1 分，51%～80%為2 分，＞80%為3 分，染色強度弱染色為1 分，中等染色為2 分，強染色為3 分，β-catenin 表達為染色強度與陽性細胞數(shù)之積，＞3 分為陽性。分值越高表達量越高。見圖1。

1.3 觀察指標

①比較miRNA-320a、hTcf-4mRNA、β-catenin在肝癌組織與癌旁組織中表達。②比較miRNA-320a 低表達與高表達、hTcf-4 陽性與陰性、β-catenin 陽性與陰性患者臨床資料、病理特征。③分析各指標與臨床特征的相關(guān)性。④比較不同預(yù)后患者各指標表達。⑤分析各指標預(yù)測預(yù)后的價值。⑥比較各指標高危與低危患者的生存曲線。⑦分析各指標間的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（±s）表示，兩兩比較采用t檢驗；計數(shù)資料用n（%）表示，行χ2檢驗；采用Spearman 分析各指標與臨床特征的相關(guān)性；采用受試者工作特征曲線（Receiver operating characteristic，ROC）曲 線 及ROC 下面積（Area under the curve，AUC）分析各指標預(yù)測預(yù)后的價值；采用卡普蘭-邁耶曲線（Kaplan-Meier，K-M）生存曲線分析；Log Rank（Mantel-Cox）檢驗各指標高危者、低危者生存曲線；采用Pearson 分析miRNA-320 mRNA 與hTcf-4 mRNA、β-catenin 的相關(guān)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-320a、hTcf-4 mRNA、β-catenin 在肝癌組織中表達

肝癌組織miRNA-320a 表達水平低于癌旁組織，hTcf-4 mRNA 表達水平高于癌旁組織，β-catenin 陽性率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 miRNA-320a、hTcf-4 mRNA、β-catenin 在肝癌組織中表達［n（%），（±s）］Table 1 miRNA-320a，hTcf-4 mRNA，β-catenin expression in liver cancer tissues［n（%），（±s）］

表1 miRNA-320a、hTcf-4 mRNA、β-catenin 在肝癌組織中表達［n（%），（±s）］Table 1 miRNA-320a，hTcf-4 mRNA，β-catenin expression in liver cancer tissues［n（%），（±s）］

組織類型肝癌組織癌旁組織t/χ2值P 值n 122 122 miRNA-320a 4.62±0.89 6.48±1.17 13.975＜0.001 hTcf-4 mRNA 0.78±0.16 0.37±0.10 24.002＜0.001 β-catenin陽性率96（78.69）28（22.95）75.824＜0.001

2.2 miRNA-320a、hTcf-4 mRNA、β-catenin 不同表達患者臨床資料比較

肝組織miRNA-320a、hTcf-4 mRNA高表達者與低表達者、β-catenin 陽性與陰性患者在分化程度、腫瘤T 分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 miRNA-320a、hTcf-4 mRNA、β-catenin 與臨床特征的相關(guān)性

miRNA-320a 與分化程度呈正相關(guān)，與腫瘤T分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)（P＜0.05）；hTcf-4mRNA、β-catenin 與分化程度呈負相關(guān)，與腫瘤T 分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P＜0.05）。見表3。

表2 miRNA-320a、hTcf-4 mRNA、β-catenin 不同表達患者臨床資料比較［n（%）］Table 2 Comparison of clinical data of patients with different expressions of miRNA-320a，hTcf-4 mRNA，and β-catenin［n（%）］

表3 miRNA-320a、hTcf-4 mRNA、β-catenin 與臨床特征的相關(guān)性Table 3 Correlation between miRNA-320a，hTcf-4 mRNA，β-catenin and clinical characteristics

2.4 不同預(yù)后患者miRNA-320a、hTcf-4 mRNA、β-catenin 表達比較

生存者miRNA-320a 表達水平高于病死者，hTcf-4mRNA、β-catenin 表達水平低于病死者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 不同預(yù)后患者miRNA-320a、hTcf-4 mRNA、β-catenin 表達比較（±s）Table 4 Comparison of miRNA-320a，hTcf-4 mRNA，βcatenin expression in patients with different prognosis（±s）

表4 不同預(yù)后患者miRNA-320a、hTcf-4 mRNA、β-catenin 表達比較（±s）Table 4 Comparison of miRNA-320a，hTcf-4 mRNA，βcatenin expression in patients with different prognosis（±s）

預(yù)后生存病死t 值P 值n 87 35 miRNA-320a 4.95±1.02 3.81±0.56 6.235＜0.001 hTcf-4 mRNA 0.63±0.13 1.15±0.22 16.166＜0.001 β-catenin（分）1.87±0.58 2.93±0.90 7.720＜0.001

2.5 ROC 分析各指標預(yù)測預(yù)后的價值

miRNA-320a預(yù)測預(yù)后的AUC為0.799（95%CI：0.717～0.866），截斷值≤4.5，敏感度為82.86%，特異度為63.22%；hTcf-4mRNA 預(yù)測預(yù)后的AUC為0.761（95%CI：0.676～0.834），截 斷 值＞0.98，敏感度為54.29%，特異度為93.10%；β-catenin 預(yù)測預(yù)后的AUC 為0.730（95%CI：0.642～0.806），截斷值＞2 分，敏感度為65.71%，特異度為73.56%（P＜0.05）。見圖2。

2.6 各指標的生存曲線

以ROC 分析截斷值為分界，分為miRNA-320a、hTcf-4mRNA、β-catenin 高危與低危患者，采用K-M 曲線分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-320a（χ2=22.400）、hTcf-4（χ2=26.292）、β-catenin（χ2=22.267）高危與低危患者的生存曲線比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

2.7 miRNA-320a 與hTcf-4 mRNA、β-catenin 的相關(guān)性

miRNA-320a 與hTcf-4mRNA 呈負相關(guān)（r=-0.524，P＜0.05），與β-catenin 呈負相關(guān)（r=-0.509，P＜0.05）。

3 討論

miRNA-320a 是miRNA-320 家族成員之一，過表達的miRNA-320a 可抑制胃癌細胞的增殖、侵襲與遷移［7］。本研究顯示，肝癌組織miRNA-320amRNA 高表達率低于癌旁組織，與分化程度呈正相關(guān)，與腫瘤T 分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)，且生存者miRNA-320a mRNA 高于病死者，提示miRNA-320a 可影響肝癌分化程度、T 分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后，可能扮演抑癌基因角色，故上調(diào)miRNA-320a 表達可能有助于改善肝癌病理特征與患者預(yù)后，這為臨床防治肝癌提供了一個新思路。Xiong W 等［8］指出，神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者miRNA-320a 的水平顯著降低，且miRNA-320a表達的升高與預(yù)后較好相關(guān)。余俊等［9］報道顯示，miRNA-320a 在上皮性卵巢癌組織中呈低表達，并與腫瘤分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究觀點與之相似。miRNA-320a 能通過靶向β-catenin信號通路，上調(diào)促凋亡基因表達，抑制肝癌細胞的增殖，從而影響肝癌患者病理特征與預(yù)后［10］。同時miRNA-320a 具有較高的預(yù)后評估價值。

表5 miRNA-320a 與hTcf-4 mRNA、β-catenin 的相關(guān)性Table 5 Correlation between miRNA-320a and hTcf-4 mRNA and β-catenin

Wnt/β-catenin 信號通路成員包括細胞外因子Wnt、β-catenin、轉(zhuǎn)錄因子T 細胞因子等，hTcf-4屬于轉(zhuǎn)錄因子T 細胞因子家族［11-12］。本研究顯示，hTcf-4mRNA 與分化程度呈負相關(guān)，與腫瘤T 分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示肝癌組織hTcf-4與患者病理特征和預(yù)后相關(guān)，從基因水平沉默hTcf-4的表達可能有助于抑制肝癌細胞的惡性行為。研究發(fā)現(xiàn)，hTcf-4 與惡性腫瘤包膜完整性、是否轉(zhuǎn)移有關(guān)，上調(diào)其表達，會促使骨肉瘤細胞的增殖和侵襲，提示hTcf-4是一種促癌基因［13-14］。hTcf-4能通過基質(zhì)金屬蛋白酶作用于細胞外基質(zhì)，為癌細胞轉(zhuǎn)移提供便利，并能激活靶基因c-myc，發(fā)揮誘癌作用［15］。

β-catenin 是Wnt/β-catenin 信號通路重要組成部分，可介導(dǎo)細胞間黏附與腫瘤細胞的增殖，并能調(diào)控腫瘤增殖、侵襲途徑相關(guān)基因的表達，抑制β-catenin 能抑制結(jié)腸癌癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移，提示β-catenin 是一種促癌基因［16］。本研究顯示，肝癌組織β-catenin 陽性率高于癌旁組織，與分化程度呈負相關(guān)，與腫瘤T 分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，在生存者中表達低于病死者，可影響患者預(yù)后。范奕紅等［17］指出，肝癌組織中β-catenin表達與臨床分期、腫瘤分化程度、肝外轉(zhuǎn)移相關(guān)，支持本研究結(jié)論，但其指出β-catenin 表達與腫瘤直徑無關(guān)，與本研究觀點不同，可能與納入病例數(shù)、病例的病情不同有關(guān)，有待后續(xù)進一步驗證。同時本研究還發(fā)現(xiàn)，miRNA-320a 與hTcf-4mRNA、β-catenin呈負相關(guān)，提示各指標間可相關(guān)影響，但其詳細作用途徑尚不清晰。受限于實際情況，本實驗樣本量較少，有待后續(xù)擴大病例數(shù)進行深入的探討。

綜上所述，肝癌組織miRNA-320a 呈低表達，hTcf-4、β-catenin 呈高表達，均與分化程度、腫瘤T 分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，并能預(yù)測患者預(yù)后。