基因編輯及其在疾病治療中的應(yīng)用研究進(jìn)展

華亮 朱冰

DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)的提出，開啟了現(xiàn)代分子生物學(xué)的時(shí)代。從此，人類對(duì)疾病尤其是遺傳性疾病的認(rèn)識(shí)進(jìn)入了DNA 分子層面。隨著基因測序技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的疾病的分子機(jī)理被發(fā)現(xiàn)。2015年美國總統(tǒng)奧巴馬提出“精準(zhǔn)醫(yī)療”的概念，通過修改或編輯基因序列的方式進(jìn)行個(gè)體化疾病治療越來越成為研究和關(guān)注的熱點(diǎn)。

1 基因編輯的原理

基因編輯技術(shù)的基本原理大致相同：通過人工核酸內(nèi)切酶，精確靶向特異性切割DNA 雙鏈誘導(dǎo)形成位點(diǎn)特異性的DNA 雙鏈斷裂（doublestrand break，DSB），DSB 產(chǎn)生后，激活細(xì)胞啟動(dòng)兩種主要的天然修復(fù)機(jī)制：非同源末端連接（NHEJ）和同源重組修復(fù)（HRR）。通常，細(xì)胞主要通過NHEJ 方式進(jìn)行修復(fù)，NHEJ 在斷裂DNA 修復(fù)重連的過程中，能夠在DSB 位點(diǎn)產(chǎn)生堿基隨機(jī)插入或缺失（indel），常造成移碼突變使基因失活，從而實(shí)現(xiàn)目的基因的敲除。若一個(gè)外源性供體基因序列存在，NHEJ 機(jī)制會(huì)將其連入雙鏈斷裂DSB 位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)的外源基因敲入。當(dāng)一個(gè)帶有同源臂的重組供體存在時(shí)，細(xì)胞還會(huì)采取HDR 的方式對(duì)DSB 進(jìn)行修復(fù)，供體中的外源目的基因會(huì)通過同源重組過程完整的整合到靶位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)特定位點(diǎn)的精確插入、缺失或者堿基置換，而不會(huì)出現(xiàn)隨機(jī)的堿基插入或丟失。

2 基因編輯的簡要發(fā)展歷程

1986年，Smithies 等［1］提出同源重組能夠被應(yīng)用于人類疾病的治療，標(biāo)志著基因組編輯時(shí)代的開啟。同年，Kirk R 等［2］用核內(nèi)注射的方法對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)染色體上由突變造成的基因缺陷進(jìn)行修復(fù)時(shí)首次提出基因編輯的概念。

借助不同的核酸內(nèi)切酶平臺(tái)，研究人員能夠在靶基因組中制造位點(diǎn)特異性的DNA 斷裂點(diǎn)。伴隨著用于基因編輯的人工核酸內(nèi)切酶平臺(tái)的發(fā)展，其介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)也歷經(jīng)了多個(gè)階段的變革。

2.1 大范圍核酸酶技術(shù)

大范圍核酸酶是一種具有較大切割位點(diǎn)（12～45 bp）的序列特異性核酸內(nèi)切酶。研究者將其用于細(xì)胞系誘導(dǎo)靶序列附近產(chǎn)生DSB，以達(dá)到在基因組中敲除內(nèi)源基因或敲入外源基因的目的，或矯正與單基因疾病相關(guān)的突變。它的編輯精度高，自身編碼基因較小，易包裝入AAV 載體中。但是，由于其種類限制，以及大部分大范圍核酸酶很難在人基因組上找到合適的位點(diǎn)，使其廣泛應(yīng)用受到限制。

2.2 鋅指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）技術(shù)

ZFP 是一類通過Cys2-His2 鋅指結(jié)構(gòu)域結(jié)合DNA 的轉(zhuǎn)錄因子。ZFN 主要包括用于識(shí)別和結(jié)合特定DNA 序列重復(fù)的ZFP 和可以通過二聚體化非特異地切割DNA 的核酸內(nèi)切酶Fok I。利用一對(duì)串聯(lián)的鋅指結(jié)合特異DNA，將Fok I 的兩個(gè)亞基帶到特定基因組位點(diǎn)，對(duì)DNA 進(jìn)行切割產(chǎn)生DSB。該技術(shù)靶向結(jié)合效率高，但是其識(shí)別特定DNA 的鋅指序列需要通過文庫篩選來確定，鋅指核酸酶存在上下游DNA 序列的依賴效應(yīng)，進(jìn)一步加大了篩選的難度，無法實(shí)現(xiàn)對(duì)任意靶基因的結(jié)合，亦無法實(shí)現(xiàn)高通量的基因編輯。且可能產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞毒性，對(duì)其推廣運(yùn)用造成了一定的影響。

2.3 轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）技術(shù)

與ZFN 相似，TALEN 也由兩部分構(gòu)成，一部分是由33-35 個(gè)氨基酸的重復(fù)單元組成，通過位于12 位和13 位的兩個(gè)可變氨基酸殘基識(shí)別并結(jié)合DNA 序列，其唯一靶向限制是對(duì)N 端結(jié)構(gòu)有5′T的要求，所以，理論上可以通過構(gòu)建不同的位于12位和13 位的兩個(gè)可變氨基酸殘基達(dá)到靶向幾乎任何DNA 序列的目的。另一部分是與ZFN 相同的限制性核酸內(nèi)切酶Fok I。TALEN 技術(shù)在一定程度上克服了ZFN 技術(shù)存在的脫靶問題，設(shè)計(jì)簡單，特異性和活性更高。目前，已在人類多功能干細(xì)胞和體細(xì)胞中有效誘導(dǎo)NHEJ 和HDR。但是，TALEN 的體積比ZFN 大，使得某些病毒傳遞系統(tǒng)的包裝較困難，從而限制了其用于高通量的基因編輯。

2.4 成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列/成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列關(guān)聯(lián)蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins，CRISPR/Cas）技術(shù)

CRISPR/Cas9 技術(shù)通過sgRNA 與靶標(biāo)DNA中相對(duì)保守的PAM 序列的上游基因互補(bǔ)配對(duì)，再經(jīng)Cas9 蛋白對(duì)靶標(biāo)基因進(jìn)行切割。通過設(shè)計(jì)與目標(biāo)片段匹配的sgRNA，就可以精確地定位到所有的DNA 位置，然后由Cas9 剪切DNA 形成DBS。為了避免NHEJ 出現(xiàn)基因變異，可使用外源DNA模板進(jìn)行HDR，對(duì)靶標(biāo)基因進(jìn)行修飾，從而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)基因編輯。且CRISPR 系統(tǒng)可以同時(shí)靶向多個(gè)基因，這對(duì)研究復(fù)雜的人類疾病上是一個(gè)巨大的進(jìn)步。與ZFN 和TALEN 相比，CRISPR/Cas9 設(shè)計(jì)簡便、成本低、效率高，可用于高通量的基因編輯。然而，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)也有其不足之處，主要體現(xiàn)在功能發(fā)揮時(shí)系統(tǒng)對(duì)DNA 上PAM 序列的依賴性以及切割時(shí)潛在的脫靶效應(yīng)。在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，Cas9 只在具有PAM 序列且可以與sgRNA 互補(bǔ)配對(duì)的靶序列發(fā)生切割。基于這些需要改善的方面，研究人員開創(chuàng)性地發(fā)現(xiàn)了一些識(shí)別更多樣PAM 的CRISPR/Cas 系統(tǒng)，這些優(yōu)化或改造的Cas9 可降低50～1 500 倍的脫靶率，極大地解決了脫靶問題。

2.5 單堿基編輯（Base editor，BE）技術(shù)

2016年，哈佛大學(xué)的David Liu 實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了一種基于脫氨酶與CRISPR/Cas9 系統(tǒng)融合形成的BE 技術(shù)［3］：由sgRNA 和經(jīng)過改造的Cas9、胞嘧啶脫氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制子組成的復(fù)合體。胞嘧啶脫氨酶可將胞嘧啶脫氨基變?yōu)槟蜞奏ぃ贒NA 復(fù)制過程中則變?yōu)樾叵汆奏ぁE 技術(shù)不引入DSB，不需要重組修復(fù)模板，且效率遠(yuǎn)高于由DSB 引起的同源重組修復(fù)，對(duì)許多點(diǎn)突變造成的疾病具有很大的應(yīng)用潛能。

2.6 表觀基因組編輯和轉(zhuǎn)錄調(diào)控

表觀遺傳修飾和轉(zhuǎn)錄調(diào)控是把各種表觀調(diào)控效應(yīng)器融合到工程化缺陷型核酸酶（dCas9）上，利用dCas9 靶向識(shí)別并結(jié)合DNA 的特性，實(shí)現(xiàn)在特定位點(diǎn)上表觀基因組的編輯。這些調(diào)控效應(yīng)器同dCas9 的結(jié)合拓展了CRISPR 在轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表觀基因組編輯的應(yīng)用范圍，且dCas9 的表觀基因組編輯具有很高的安全性和特異性，無明顯的脫靶效應(yīng)，為體內(nèi)表觀基因修飾和治療奠定了基礎(chǔ)。

3 基因編輯在疾病治療中的應(yīng)用

基因編輯治療人類疾病在體內(nèi)和體外都取得了成功。體內(nèi)基因治療包括組織特異性靶向，局部遞送或靶細(xì)胞特異性基因表達(dá)；而離體療法靶向體外的細(xì)胞，這些修飾的細(xì)胞可用于疾病建模或用作治療劑。

3.1 體外基因編輯

體外基因編輯是從病人身上提取相應(yīng)的細(xì)胞，在基因編輯后將細(xì)胞移植回患者相應(yīng)部位以達(dá)到治療疾病的目的的治療方法。該技術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)在于它消除了捐贈(zèng)者組織與移植者之間的免疫排斥。將所需基因轉(zhuǎn)移到造血干細(xì)胞，然后移植給患者已經(jīng)改善甚至治療了血液系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的單基因病。如：X 連鎖嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷、腺苷脫氨酶、嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷、腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、異染性白質(zhì)營養(yǎng)不良、Wiskott-Aldrich綜合征和β-地中海貧血［4-5］。

通過基因編輯和NHEJ 對(duì)目的基因進(jìn)行插入或敲除操作研究已經(jīng)應(yīng)用于包括鐮狀細(xì)胞病和地中海貧血在內(nèi)的血紅蛋白病［6］。使用HRR 進(jìn)行基因編輯也顯示出巨大潛力。如在影響造血系統(tǒng)的遺傳缺陷中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多疾病，包括溶酶體酶缺乏癥［7］，地中海貧血［8］，慢性肉芽腫病［9］和X 連鎖高IgM 綜合征［10］。

3.2 體內(nèi)基因編輯

當(dāng)受影響的細(xì)胞或組織無法從患者身上獲得，或者離體操作后無法有效地移植回患者體內(nèi)，則必須進(jìn)行體內(nèi)基因編輯。

杜氏肌營養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是基因突變引起的，導(dǎo)致骨骼肌和心肌進(jìn)行性變性。利用AAV 載體將Cas9 和sgRNAs遞送到DMD 小鼠體內(nèi)，能夠使DMD 基因外顯子缺失，靶細(xì)胞再通過NHEJ 對(duì)目的基因進(jìn)行修復(fù)，從而部分恢復(fù)閱讀框，使骨骼肌和心肌的生化和功能改善［11-12］。

利用AAV 載體結(jié)合NHEJ 的基因編輯方法被用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的遺傳病。學(xué)者們將所需成分直接注射到患者視網(wǎng)膜或大腦中治療這些疾病。如亨廷頓舞蹈癥［13］，常染色體顯性遺傳性視網(wǎng)膜色素變性［14］，以及萊伯先天性黑蒙癥10［15］。

對(duì)于需要基因較正或基因替代進(jìn)行治療的疾病，其治療方式是使患者體內(nèi)獲得足夠的體內(nèi)HRR。這種方法已被用于治療一些肝臟代謝性疾病：鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥［16］、乙型血友病［17］、黏多糖貯積癥Ⅰ、黏多糖貯積癥Ⅱ、法布雷病和戈謝病［18-19］。學(xué)者們還通過敲除同一代謝途徑中的基因，將Ⅰ型酪氨酸血癥轉(zhuǎn)變?yōu)楦夹缘蘑笮屠野彼嵫Y［20］。

3.3 病毒性疾病的基因編輯

基因編輯同樣被用于病毒性疾病。研究人員通過gRNA 和用AAVs 轉(zhuǎn)染的Cas9 成功去除了HIV 轉(zhuǎn)基因小鼠中跨LTR 和gag 區(qū)的病毒DNA 基因組［21］。一項(xiàng)針對(duì)病毒逃逸和突變的單獨(dú)研究表明，靶向HIV 基因組兩個(gè)不同區(qū)域的兩個(gè)強(qiáng)gRNA可以完全阻止病毒復(fù)制［22］。

乙型肝炎具有共價(jià)閉合的環(huán)狀DNA（cccDNA），其在肝臟中處于休眠狀態(tài)，且cccDNA 充當(dāng)慢性感染和再激活轉(zhuǎn)錄的模板，因此抗病毒藥無法成功消除該病毒。研究人員通過HBV 靶向gRNA，并利用Cas9 切割cccDNA，造成多個(gè)缺失和突變，隨后通過宿主的NHEJ 機(jī)制對(duì)其進(jìn)行了修復(fù)。結(jié)果顯示可以將HBV 感染減少多達(dá)八倍［23］。

3.4 表觀遺傳學(xué)疾病的基因編輯

表觀遺傳修飾的失調(diào)與多種人類疾病有關(guān)，基因編輯技術(shù)的應(yīng)用為表觀遺傳機(jī)制異常疾病的研究和治療創(chuàng)造了一種全新的方法。如，在自然界中，表觀遺傳沉默可以導(dǎo)致靶基因表達(dá)在多個(gè)有絲分裂過程中完全減弱。通過靶向組蛋白和DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶的不同組合在不同的位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因最大程度的抑制［24］。基于神經(jīng)元優(yōu)化的CRISPR 系統(tǒng)能夠在多個(gè)主要嚙齒動(dòng)物神經(jīng)元培養(yǎng)系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)強(qiáng)大，模塊化和可調(diào)的基因誘導(dǎo)以及多重基因調(diào)控［25］。研究證明，Cas9 系統(tǒng)在體內(nèi)可以通過反表觀遺傳重塑激活內(nèi)源性靶基因［26］，并被用于糖尿病，肌肉營養(yǎng)不良和急性腎臟疾病的小鼠模型中。此外，CRISPR-Cas9 還被用于體內(nèi)小鼠視網(wǎng)膜色素變性模型中，通過使Nrl（棒狀光感受器的主要調(diào)節(jié)基因）失活而將棒狀光感細(xì)胞重編程為圓錐狀細(xì)胞，證明CRISPR-Cas9 可通過轉(zhuǎn)錄抑制防止視力喪失［27］。

4 結(jié)語與展望

在過去的十年中，基因編輯取得了長足的進(jìn)步。特別是2013年后，隨著CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的開發(fā)，我們?nèi)〉昧烁蟮倪M(jìn)步。借助這些工具，我們已經(jīng)擁有了一類全新的療法來治療甚至治愈以前缺乏有效干預(yù)措施的疾病。基因編輯技術(shù)將被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的許多領(lǐng)域并將徹底改變這些領(lǐng)域。雖然，目前這一技術(shù)還需要加以完善。但是，我們相信：一旦該技術(shù)變得更普及，無疑將使患者受益。而這些技術(shù)肯定會(huì)得到進(jìn)一步完善，并在未來的某一天可能會(huì)成為許多疾病的主流療法。