鹽酸羥考酮負調控LncRNA LINC01857抑制宮頸癌細胞Siha增殖、遷移及侵襲

張秀雙 徐銘軍 車向明 曹秀玲 李曉光

宮頸癌是威脅女性生命安全的惡性腫瘤之一，近年來，我國宮頸癌發(fā)病率逐年上升，已嚴重影響患者生活質量，臨床常采用手術、放化療結合等方式進行治療［1］。丙泊酚可通過EGFR/JAK2/STAT3 途徑增強順鉑誘導的宮頸癌細胞凋亡，可作為治療宮頸癌的潛在藥物［2］。丙泊酚通過抑制HOTAIR 而抑制宮頸癌細胞活力并促進細胞凋亡［3］。鹽酸羥考酮是一種半合成的蒂巴因衍生物，屬于麻醉藥物，可明顯減輕腫瘤患者疼痛感［4］。但鹽酸羥考酮對宮頸癌細胞生物學行為的影響尚未闡明。特定的長鏈非編碼RNA（LncRNA）在宮頸癌中表達異常，可調節(jié)細胞增殖、遷移及侵襲等生物學行為［5］。長鏈非編碼RNA LINC01857（LncRNA LINC01857）在乳腺癌中表達水平升高，并可能發(fā)揮類癌基因作用［6］。但LINC01857 是否可作為鹽酸羥考酮治療宮頸癌的潛在靶點尚未闡明。因此，本研究主要探討鹽酸羥考酮聯(lián)合LINC01857 對宮頸癌細胞Siha 增殖、遷移及侵襲的影響及其潛在作用機制，為進一步闡釋鹽酸羥考酮治療宮頸癌的分子機制奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸羥考酮購自北京華素制藥股份有限公司；人宮頸癌細胞Siha 購自上海信裕生物科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)基購自北京邁瑞達科技有限公司；胎牛血清購自上海傳秋生物科技有限公司；Lipofectamine2000 購自上海北諾生物科技有限公司；si-NC、si-LINC01857 購自廣州銳博生物科技有限公司；pcDNA、pcDNA-LINC01857 購自武漢淼靈生物科技有限公司；Trizol 試劑購自北京全式金生物技術有限公司；cDNA 合成試劑盒與qRT-PCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；MTT 試劑購自北京索萊寶科技有限公司；Transwell 小室、Matrigel 基質膠購自上海澤邁生物技術有限公司；兔抗人E-cadherin、N-cadherin 抗體購自美國CST公司；HRP 標記的山羊抗兔二抗購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組Siha 細胞接種于96 孔板（5×103個/孔），分別加入含有不同濃度（20、40、60 μg/mL）的鹽酸羥考酮的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h［7］，分別記作鹽酸羥考酮低劑量組、鹽酸羥考酮中劑量組、鹽酸羥考酮高劑量組。同時將正常培養(yǎng)的細胞作為對照組。參照Lipofectamine2000 試劑盒說明書分別將si-NC、si-LINC01857 轉染至Siha 細胞，分別記作si-NC組、si-LINC01857組。分別將pcDNA、pcDNALINC01857 轉染至Siha 細胞，加入含有60 μg/mL鹽酸羥考酮的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，分別記作鹽酸羥考酮高劑量+pcDNA 組、鹽酸羥考酮高劑量+pcDNA-LINC01857 組。

1.2.2 qRT-PCR檢測細胞中LINC01857的表達水平采用Trizol 法提取Siha 細胞總RNA，應用Nanodrop2000c 超微量分光光度計檢測RNA 濃度后置于-80℃超低溫冰箱內保存，按照cDNA 合成試劑盒將總RNA 逆轉錄為cDNA，以cDNA 為模板進行qRT-PCR 反應，反應體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgSO42.5 μL，dNTPs 2.5 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free ddH2O 補足體系至25 μL；反應條件：95℃2 min，95℃30 s，59℃30 s，72℃30 s，共36 次 循 環(huán)。應 用 羅 氏LightCycler480 熒光定量PCR 儀檢測LINC01857（內參GAPDH）相對表達量。

1.2.3 MTT 檢測細胞增殖

取對數(shù)生長期Siha 細胞（2.5×105個/mL）接種于96 孔板（100 μL/孔），按照“1.2.1”分組處理后加入MTT 溶液（20 μL/孔），繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄上清，加入DMSO（150 μL/孔），室溫振蕩孵育5 min 后應用酶標儀檢測各孔光密度值（OD 值）。

1.2.4 平板克隆形成實驗

取各組Siha 細胞接種于6 孔板（1×103個/孔），繼續(xù)培養(yǎng)14 d 后棄舊培養(yǎng)基，加入預冷PBS 洗滌后加入甲醇（500 μL/孔），置于-20℃冰箱內孵育20 min，棄甲醇，加入1%結晶紫染色液染色（400 μL/孔，15 min），蒸餾水洗滌后晾干，觀察克隆形成數(shù)。

1.2.5 Transwell 實驗檢測細胞遷移與侵襲

各組Siha 細胞（2.5×105個/mL）接種于上室（200 μL/孔），下室加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液（600 μL/孔），繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后使用PBS 洗滌，分別加入多聚甲醛（20 min）與結晶紫染液（10 min），觀察遷移細胞數(shù)。預冷培養(yǎng)基被用于稀釋Matrigel 基質膠后加入上室（40 μL/孔），繼續(xù)培養(yǎng)5 h，后續(xù)實驗步驟同細胞遷移實驗，觀察侵襲細胞數(shù)。

1.2.6 Western blot 檢測E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達

各組Siha 細胞加入RIPA 裂解液提取細胞總蛋白（500 μL），使用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，取蛋白樣品進行SDS-PAGE，轉膜、封閉，分別孵育一抗稀釋液（1∶1 000，4℃孵育24 h）與二抗稀釋液（1∶5 000，室溫孵育1 h）后應用ImageJ 軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以（±s）表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 鹽酸羥考酮對Siha 增殖及LINC01857 表達的影響

4 組LINC01857 的表達水平、OD 值、克隆形成數(shù)的比較結果顯示：鹽酸羥考酮低劑量組＞鹽酸羥考酮中劑量組＞鹽酸羥考酮高劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 鹽酸羥考酮對Siha 遷移、侵襲的影響

4 組N-cadherin、遷移細胞數(shù)（個）、侵襲細胞數(shù)（個）比較結果：鹽酸羥考酮低劑量組＞鹽酸羥考酮中劑量組＞鹽酸羥考酮高劑量組；E-cadherin 結果比較：鹽酸羥考酮低劑量組＜鹽酸羥考酮中劑量組＜鹽酸羥考酮高劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1、表2。

表1 鹽酸羥考酮對Siha 細胞活性、克隆形成及LINC01857 表達的影響（±s，n=3）Table 1 Effects of oxycodone hydrochloride on the activity，clone formation and LINC01857 expression of SiHa cells（±s，n=3）

表1 鹽酸羥考酮對Siha 細胞活性、克隆形成及LINC01857 表達的影響（±s，n=3）Table 1 Effects of oxycodone hydrochloride on the activity，clone formation and LINC01857 expression of SiHa cells（±s，n=3）

分組對照組鹽酸羥考酮低劑量組鹽酸羥考酮中劑量組鹽酸羥考酮高劑量組F 值P 值LINC01857 0.98±0.05 0.95±0.04 0.68±0.04 0.35±0.02 168.787 0.000 OD 值1.30±0.07 1.27±0.07 0.92±0.05 0.70±0.04 72.022 0.000克隆形成數(shù)（個）115.00±3.27 111.33±2.87 87.33±2.62 64.00±2.16 221.292 0.000

2.3 干擾LINC01857 對Siha 增殖、遷移、侵襲的影響

與si-NC 組比較，si-LINC01857 組OD 值降低，克隆形成數(shù)減少，遷移及侵襲細胞數(shù)減少，N-cadherin 蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），E-cadherin 蛋白水平升高差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3、圖2。

表2 鹽酸羥考酮對Siha 遷移侵襲的影響（±s）Table 2 Effect of oxycodone hydrochloride on migration and invasion of SiHa（±s）

表2 鹽酸羥考酮對Siha 遷移侵襲的影響（±s）Table 2 Effect of oxycodone hydrochloride on migration and invasion of SiHa（±s）

分組對照組鹽酸羥考酮低劑量組鹽酸羥考酮中劑量組鹽酸羥考酮高劑量組F 值P 值n3333 E-cadherin 0.18±0.01 0.19±0.01 0.37±0.02 0.64±0.04 252.545 0.000 N-cadherin 0.68±0.04 0.66±0.04 0.39±0.03 0.25±0.02 117.778 0.000遷移細胞數(shù)（個）235.33±4.19 230.67±4.71 194.33±3.86 152.00±3.27 274.717 0.000侵襲細胞數(shù)（個）135.33±4.19 131.67±3.77 98.00±2.45 70.67±2.05 266.580 0.000

表3 干擾LINC01857 對Siha 增殖遷移侵襲的影響（±s）Table 3 Effects of interference with LINC01857 on proliferation，migration and invasion of SiHa（±s）

表3 干擾LINC01857 對Siha 增殖遷移侵襲的影響（±s）Table 3 Effects of interference with LINC01857 on proliferation，migration and invasion of SiHa（±s）

分組si-NC si-LINC01857 t 值P 值n33 LINC01857 0.99±0.05 0.19±0.02 25.731 0.000 E-cadherin 0.17±0.01 0.73±0.04 23.525 0.000 N-cadherin 0.69±0.04 0.14±0.01 23.105 0.000 OD 值1.32±0.08 0.54±0.03 15.812 0.000克隆形成數(shù)（個）117.00±3.27 54.33±2.05 28.125 0.000遷移細胞數(shù)（個）236.33±4.03 127.67±2.49 39.729 0.000侵襲細胞數(shù)（個）137.33±4.11 61.33±2.87 26.260 0.000

2.4 過表達LINC01857 能減輕鹽酸羥考酮對Siha增殖的影響

與鹽酸羥考酮高劑量+pcDNA 組比較，鹽酸羥考酮高劑量+pcDNA-LINC01857 組OD 值升高，克隆形成數(shù)增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4。

2.5 過表達LINC01857 能減輕鹽酸羥考酮對Siha遷移、侵襲的影響

與鹽酸羥考酮高劑量+pcDNA 組比較，鹽酸羥考酮高劑量+pcDNA-LINC01857 組遷移及侵襲細胞數(shù)增多，E-cadherin 蛋白水平降低，N-cadherin蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3、表5。

3 討論

丙泊酚通過激活AMPK 及促進內質網應激而抑制宮頸癌細胞增殖及促進細胞凋亡［8］。利多卡因通過調節(jié)LncRNA-MEG3/miR-421/BTG1 途徑抑制宮頸癌細胞增殖并誘導細胞凋亡［9］。麻醉藥物可調控宮頸癌等腫瘤細胞增殖、分化等生物學過程，但關于其作用機制尚未闡明［10］。因而本研究積極探尋麻醉藥物對宮頸癌細胞生物學行為的影響及其可能作用機制，為提高宮頸癌治療效果及改善患者預后提供新方向。

表4 過表達LINC01857 能減輕鹽酸羥考酮對Siha 增殖的抑制作用（±s，n=3）Table 4 Overexpression of LINC01857 can reduce the inhibitory effect of oxycodone hydrochloride on the proliferation of SiHa（±s，n=3）

表4 過表達LINC01857 能減輕鹽酸羥考酮對Siha 增殖的抑制作用（±s，n=3）Table 4 Overexpression of LINC01857 can reduce the inhibitory effect of oxycodone hydrochloride on the proliferation of SiHa（±s，n=3）

分組鹽酸羥考酮高劑量+pcDNA鹽酸羥考酮高劑量+pcDNA-LINC01857 t 值P 值LINC01857 0.34±0.02 0.89±0.05 17.690 0.000 OD 值0.71±0.03 1.13±0.07 9.552 0.000克隆形成數(shù)（個）65.00±2.45 104.67±3.30 16.718 0.000

表5 過表達LINC01857 能減輕鹽酸羥考酮對Siha 遷移、侵襲的抑制作用（±s）Table 5 overexpression of LINC01857 can reduce the inhibition of oxycodone hydrochloride on migration and invasion of SiHa（±s）

表5 過表達LINC01857 能減輕鹽酸羥考酮對Siha 遷移、侵襲的抑制作用（±s）Table 5 overexpression of LINC01857 can reduce the inhibition of oxycodone hydrochloride on migration and invasion of SiHa（±s）

分組鹽酸羥考酮高劑量+pcDNA鹽酸羥考酮高劑量+pcDNA-LINC01857 t 值P 值n33 E-cadherin 0.62±0.04 0.26±0.02 13.943 0.000 N-cadherin 0.25±0.02 0.53±0.04 10.844 0.000遷移細胞數(shù)（個）151.33±3.86 221.67±4.19 21.385 0.000侵襲細胞數(shù)（個）71.00±2.16 118.67±3.86 18.667 0.000

羥考酮是一種阿片類藥物，用于治療癌癥患者的疼痛，關于羥考酮對癌細胞的作用知之甚少［11-13］。本研究結果顯示，不同劑量的鹽酸羥考酮處理后可降低宮頸癌細胞活力，減少克隆形成數(shù)、遷移及侵襲細胞數(shù)，并可促進E-cadherin 的表達及抑制N-cadherin 的表達，且呈劑量依賴性。研究表明E-cadherin 與N-cadherin 屬于上皮-間質轉化（EMT）的標志物，E-cadherin 表達水平升高可抑制EMT 轉化，而N-cadherin 表達水平升高可促進EMT 轉化，EMT 轉化后可促進腫瘤細胞轉移［14］。提示鹽酸羥考酮可抑制宮頸癌細胞增殖、遷移及侵襲，其作用機制可能與調控EMT 轉化有關。

本研究結果顯示，不同劑量的鹽酸羥考酮處理后可明顯降低LINC01857 的表達水平，且呈劑量依賴性。研究表明LINC01857 在胰腺癌中表達水平升高，并可能作為診斷胰腺癌的潛在生物標志物［15］。LINC01857 通過調節(jié)miR-1281/TRIM65 軸促進神經膠質瘤的生長、遷移和侵襲［16］。LINC01857 通過調節(jié)miR-200b 促進胃癌的發(fā)展［17］。提示鹽酸羥考酮可能通過下調LINC01857 的表達從而發(fā)揮作用。本研究結果提示干擾LINC01857 表達可降低宮頸癌細胞增殖、遷移及侵襲能力。

綜上所述，鹽酸羥考酮通過下調LINC01857的表達從而抑制宮頸癌細胞增殖、遷移及侵襲，LINC01857 可能作為宮頸癌治療的潛在靶點，還可為進一步揭示鹽酸羥考酮抗宮頸癌的分子機制奠定實驗基礎。