下調(diào)miR-4262抑制肺癌細(xì)胞A549轉(zhuǎn)移潛能的機(jī)制

朱麗 龔波

肺癌具有早期臨床特征不明顯、惡性程度高等特點(diǎn)，很多肺癌患者在確診時已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移，并且很多肺癌患者死于肺癌轉(zhuǎn)移［1］。腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）能力的大小與腫瘤轉(zhuǎn)移水平有關(guān)，降低腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能、抑制腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移是目前抗腫瘤研究的重點(diǎn)。微小RNA（microRNA，miRNA）是一個人體內(nèi)普遍表達(dá)的非編碼RNA 分子，具有很多生物學(xué)作用，如細(xì)胞生長、胚胎發(fā)育、疾病發(fā)生、免疫調(diào)控等，miRNA 通過復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制影響生命進(jìn)程［2］。隨著人們對miRNA的不斷深入研究發(fā)現(xiàn)，疾病的發(fā)生與多種miRNA的表達(dá)關(guān)系密切，miRNA 可能是疾病診斷、治療的分子靶標(biāo)［3］。在腫瘤中的研究顯示，miRNA 參與腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，分子靶向miRNA 有望成為腫瘤治療重要途徑［4］。目前對于miR-4262 在肺癌細(xì)胞侵襲、遷移和EMT 中的作用還未明確。本次實(shí)驗(yàn)探討miR-4262 對肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的影響和機(jī)制，以期為尋找有效的分子標(biāo)記物治療肺癌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

miRcute 增強(qiáng)型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRcute 增強(qiáng)型miRNA 熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green）、Quant one step qRT-PCR Kit（SYBR Green）均購自天根生化科技（北京）有限公司；vimentin 抗體、KLF3 抗體購自美國Abcam；E-cadherin 抗體和HRP 標(biāo)記的二抗均購自美國Santa Cruz Biotechnology；inhibitor control、miR-4262 inhibitor 購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；WT（野生型）和MUT（突變型）熒光素酶報告載體由吉滿生物科技（上海）有限公司構(gòu)建；KLF3 siRNA 和siRNA control 由天津賽爾生物技術(shù)有限公司構(gòu)建合成；肺癌細(xì)胞NCI-H446、A549、NL9980 購自美國ATCC；正常支氣管上皮細(xì)胞HBE 購自上海銘博生物科技有限公司。

1.2 qRT-PCR 方法測定miR-4262 和KLF3 mRNA表達(dá)

分別用Trizol 試劑提取收集的NCI-466，A549，NL9980，同時提取肺癌細(xì)胞NCI-H446、A549、NL9980 和正常支氣管上皮細(xì)胞HBE 的總RNA。miR-4262 檢測用miRcute 增強(qiáng)型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以miRcute 增強(qiáng)型miRNA 熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green）進(jìn)行PCR 反應(yīng)，結(jié)果以U6 作為內(nèi)參，2-△△Ct 法計算。KLF3 mRNA 檢測用Quant one step qRT-PCR Kit（SYBR Green）進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng)，結(jié)果以GAPDH 為內(nèi)參，2-△△Ct 法計算。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染分組

肺癌細(xì)胞A549 分成3 組，分別為Control、Anti-NC、Anti-miR-4262 組，Anti-NC、Anti-miR-4262 組分別為轉(zhuǎn)染inhibitor control、miR-4262 inhibitor 的肺癌細(xì)胞，Control 為空白對照細(xì)胞。細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作方法完全按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 操作說明進(jìn)行。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，用qRTPCR 方法測定miR-4262 和KLF3 mRNA 表達(dá)變化，步驟同1.2。

1.4 MTT 方法測定增殖

分別按照Control、Anti-NC、Anti-miR-4262 組分組方法將細(xì)胞按照每個孔內(nèi)4 000 個細(xì)胞接種至96 孔板中，培養(yǎng)48 h 后取出培養(yǎng)板，加MTT，于37℃條件下孵育4 h。添加150 μL 的二甲基亞砜溶液，10 min，檢測每個孔的OD 值，OD 值越高，細(xì)胞增殖能力也就越強(qiáng)。

1.5 Transwell 小室測定侵襲和遷移

在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)之前需要基質(zhì)膠包被小室，遷移實(shí)驗(yàn)前省去包被步驟，其余相同甲醇固定，結(jié)晶紫染色。顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞穿膜數(shù)目。

1.6 Western blot測定E-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)

常規(guī)方法提取Control、Anti-NC、Anti-miR-4262 組細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE 凝膠用5%的濃縮膠和10 %的分離膠；電泳電壓為90 V 恒壓電泳0.5 h（觀察染料即將進(jìn)入分離膠），然后以120 V 恒壓電泳2 h。在60 V 恒壓條件下轉(zhuǎn)膜。將NC 膜浸泡在含有5%脫脂奶粉的封閉液中封閉；把NC膜置于一抗中，4℃過夜；NC 膜放在二抗中結(jié)合2 h。ECL 顯色。Image J 分析條帶的OD 值，把GAPDH 作為內(nèi)參。E-cadherin、vimentin 一抗以1∶1 000 稀釋，二抗以1∶2 000 稀釋。

1.7 靶基因預(yù)測和鑒定

生物信息學(xué)軟件（Targetscan）預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-4262 和KLF3 的3′UTR 端有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，利用熒光素酶報告系統(tǒng)鑒定二者的靶向關(guān)系。將WT和MUT 熒光素酶報告載體分別與inhibitor control、miR-4262 inhibitor 共轉(zhuǎn)染后肺癌細(xì)胞A549中。用熒光素酶活性測定試劑盒檢測細(xì)胞熒光素酶活性變化。同時收集Control、Anti-NC、Anti-miR-4262 組細(xì)胞，用qRT-PCR 和Western blot方法分別檢測細(xì)胞中KLF3mRNA 和蛋白表達(dá)變化，步驟同1.2 和1.6。

1.8 KLF3 siRNA 對下調(diào)miR-4262 逆轉(zhuǎn)功能檢測

分別在肺癌細(xì)胞A549 中將miR-4262 inhibitor、siRNA control 和miR-4262 inhibitor、KLF3 siRNA共轉(zhuǎn)染，記為Anti-miR-4262+si-NC 和Anti-miR-4262+si-KLF3 組，細(xì)胞培養(yǎng)48h 以后，MTT 測定增殖、Transwell 小室測定侵襲遷移、Western blot 測定E-cadherin、vimentin、KLF3 蛋白表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料用（±s）表示，兩組數(shù)據(jù)之間的比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-4262 在肺癌細(xì)胞中高表達(dá)

肺癌細(xì)胞NCI-H446、A549、NL9980 中miR-4262 表達(dá)水平明顯高于正常支氣管上皮細(xì)胞HBE（P＜0.05）。見表1。

表1 肺癌細(xì)胞和正常支氣管上皮細(xì)胞中miR-4262 表達(dá)水平（±s）Table 1 miR-4262 expression levels in lung cancer cells and normal bronchial epithelial cells（±s）

表1 肺癌細(xì)胞和正常支氣管上皮細(xì)胞中miR-4262 表達(dá)水平（±s）Table 1 miR-4262 expression levels in lung cancer cells and normal bronchial epithelial cells（±s）

細(xì)胞HBE NCI-H446 A549 NL9980 F 值P 值miR-4262 水平1.00±0.12 1.76±0.13 2.65±0.23 2.02±0.15 157.42＜0.001

2.2 下調(diào)miR-4262 對肺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和EMT 影響

轉(zhuǎn)染miR-4262 inhibitor 后的肺癌細(xì)胞中miR-4262 表達(dá)水平明顯降低，細(xì)胞OD 值、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目以及細(xì)胞中vimentin 蛋白表達(dá)水平均下降，E-cadherin 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），圖1和表2。

2.3 miR-4262 和KLF3 互為靶向關(guān)系

生物信息學(xué)軟件發(fā)現(xiàn)miR-4262 和KLF3 的3′UTR 端有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，并且WT-KLF3 和miR-4262 inhibitor 共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒光素酶活性升高（P＜0.05），圖2和表3。

表2 肺癌細(xì)胞OD 值、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目和E-cadherin、vimentin 蛋白水平（±s）Table 2 Lung cancer cell OD value,invasion number,migration number,and E-cadherin and vimentin protein levels（±s）

表2 肺癌細(xì)胞OD 值、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目和E-cadherin、vimentin 蛋白水平（±s）Table 2 Lung cancer cell OD value,invasion number,migration number,and E-cadherin and vimentin protein levels（±s）

組別Control Anti-NC 組Anti-miR-42 組62 F 值P 值miR-4262 1.00±0.09 0.97±0.12 0.45±0.05 103.29＜0.001 OD 值0.43±0.04 0.44±0.03 0.32±0.02 41.28＜0.001侵襲數(shù)目98.45±9.33 99.24±7.25 64.36±4.21 68.05＜0.001遷移數(shù)目125.30±10.35 126.83±11.20 85.34±7.29 52.30＜0.001 E-cadherin 0.22±0.02 0.21±0.03 0.35±0.05 43.34＜0.001 vimentin 0.56±0.05 0.54±0.04 0.33±0.02 97.40＜0.001

表3 細(xì)胞熒光素酶活性比較（±s）Table 3 Comparison of cell luciferase activity（±s）

表3 細(xì)胞熒光素酶活性比較（±s）Table 3 Comparison of cell luciferase activity（±s）

組別Anti-NC Anti-miR-426 t 值P 值MUT 1.00±0.11 0.98±0.08 0.67 0.44 WT 1.00±0.12 1.45±0.13 7.63＜0.001

2.4 下調(diào)miR-4262 對肺癌細(xì)胞中KLF3 表達(dá)影響

轉(zhuǎn)染miR-4262 inhibitor 后的肺癌細(xì)胞中KLF3 蛋白和mRNA 水平明顯升高（P＜0.05），圖3和表4。

2.5 KLF3 siRNA 逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-4262 抑制肺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、EMT 功能

與共轉(zhuǎn)染siRNA control 和miR-4262 inhibitor的肺癌細(xì)胞比較，共轉(zhuǎn)染KLF3 siRNA 和miR-4262 inhibitor 后的肺癌細(xì)胞OD 值、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目和vimentin 蛋白水平均升高，細(xì)胞中KLF3、E-cadherin 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。圖4和表5。

表4 轉(zhuǎn)染miR-4262 inhibitor 后的肺癌細(xì)胞中KLF3 蛋白和mRNA 水平比較（±s）Table 4 Comparison of KLF3 protein and mRNA levels in lung cancer cells transfected with miR-4262 inhibitor（±s）

表4 轉(zhuǎn)染miR-4262 inhibitor 后的肺癌細(xì)胞中KLF3 蛋白和mRNA 水平比較（±s）Table 4 Comparison of KLF3 protein and mRNA levels in lung cancer cells transfected with miR-4262 inhibitor（±s）

組別Control Anti-NC Anti-miR-4262 F 值P 值KLF3 蛋白0.28±0.03 0.29±0.05 0.67±0.07 160.89＜0.001 KLF3 mRNA 1.00±0.08 0.99±0.13 2.24±0.21 207.00＜0.001

3 討論

miRNA 在真核生命體中存在，并且具有十分廣泛的生物功能，miRNA 與細(xì)胞分化、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖等有關(guān)。研究顯示，miRNA 雖然沒有編碼蛋白質(zhì)的功能，但是其可以通過調(diào)控靶基因的表達(dá)發(fā)揮多種作用，廣泛的參與到機(jī)體新陳代謝、組織修復(fù)、免疫功能維持等生命活動中［5］。miRNA還參與疾病如心肌梗死、腎組織損傷等進(jìn)展，miRNA能夠通過影響細(xì)胞的生物學(xué)行為而發(fā)揮作用［6］。腫瘤細(xì)胞的惡性增殖和轉(zhuǎn)移同樣也受到miRNA的調(diào)節(jié)作用，這些與腫瘤有關(guān)的miRNA 在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮類似癌基因或抑癌基因的作用，影響細(xì)胞的增殖和侵襲過程［7］。研究報道表明，miR-4262在乳腺癌、肝癌等多種腫瘤中高表達(dá)，其可以促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移［8］。在結(jié)腸癌中的研究認(rèn)為，miR-4262 抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［9］。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示miR-4262 可能在肺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮促進(jìn)作用。

研究認(rèn)為，腫瘤的轉(zhuǎn)移除了與腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力有關(guān)以外，還與腫瘤細(xì)胞EMT 水平密切相關(guān)［10］。EMT 是廣泛存在于機(jī)體內(nèi)的正常生理過程，其在胚胎發(fā)育、組織生長過程中扮演關(guān)鍵角色。EMT 發(fā)生時，上皮細(xì)胞表型逐漸減弱而間質(zhì)細(xì)胞表型逐漸增加。E-cadherin 是上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白，vimentin 是間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白［11］。發(fā)生EMT 的腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移概率大大增加，也就是說，EMT 水平越高，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能也就越高［12］。本次的實(shí)驗(yàn)顯示，下調(diào)miR-4262 后的肺癌細(xì)胞中的E-cadherin 蛋白表達(dá)水平升高，vimentin 蛋白表達(dá)水平降低，提示下調(diào)miR-4262 可以降低肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能，這與細(xì)胞侵襲和遷移檢測結(jié)果相符合，均說明下調(diào)miR-4262 具有抑制肺癌轉(zhuǎn)移的作用。

miRNA 作用機(jī)制與靶向調(diào)控靶基因的表達(dá)有關(guān)，并且miRNA 的靶基因可能同時有多個，在不同的病理或生理進(jìn)程中的靶基因可能不同［13］。本次實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)KLF3 可以逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-4262對肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和EMT 的抑制作用，提示miR-4262 可能通過KLF3 影響肺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。

表5 肺癌細(xì)胞OD 值、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目和KLF3、E-cadherin、vimentin 蛋白水平比較（±s）Table 5 Lung cancer cell OD value，invasion number，migration number and KLF3，E-cadherin，vimentin protein level comparison（±s）

表5 肺癌細(xì)胞OD 值、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目和KLF3、E-cadherin、vimentin 蛋白水平比較（±s）Table 5 Lung cancer cell OD value，invasion number，migration number and KLF3，E-cadherin，vimentin protein level comparison（±s）

組別Anti-miR-426 組2+si-NC 組Anti-miR-4262+si 組-KLF3 組t 值P 值OD 值0.33±0.03 0.42±0.04 5.40＜0.001侵襲數(shù)目65.67±5.75 86.43±6.87 6.95＜0.001遷移數(shù)目86.32±5.76 110.54±9.04 6.78＜0.001 E-cadherin 0.39±0.06 0.23±0.04 6.67＜0.001 vimentin 0.34±0.04 0.58±0.07 8.93＜0.001 KLF3 0.63±0.08 0.32±0.04 10.40＜0.001

總之，miR-4262 在肺癌中可能發(fā)揮促進(jìn)作用，下調(diào)其表達(dá)可以通過靶向促進(jìn)KLF3 的表達(dá)降低肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能，這為研究miR-4262 在肺癌中的作用提供了參考，為靶向基因治療肺癌提供了思路。以后實(shí)驗(yàn)會在多株肺癌細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證，并且會對其在肺癌患者中的表達(dá)變化與臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行具體分析。