ASF1B對子宮內膜癌細胞惡性行為的影響及相關機制

白駒 斗澤加

據2018年數據顯示，全球子宮內膜癌新發病例約38.2 萬，死亡9.0 萬［1］，是女性高發的惡性腫瘤之一。腫瘤細胞的惡性表型是決定腫瘤進展及轉歸的關鍵因素，明確子宮內膜癌細胞的惡性行為的分子機制對于子宮內膜癌的臨床診治具有重要意義［2］。ASF1 類蛋白作為組蛋白的伴侶蛋白，在調節染色質核小體結構中發揮促進組蛋白沉積和組蛋白交換的關鍵作用［3］，是重要的表觀調控因子。有研究指出，抗沉默功能1B（Anti-Silencing Function 1B，ASF1B）蛋白參與乳腺癌、前列腺癌及腎透明細胞癌等惡性腫瘤的發生發展［4-6］，但其在子宮內膜癌中的生物學功能及作用機制仍不明確。本研究通過生物信息技術及分子生物學方法，分析了ASF1B 與子宮內膜癌細胞惡性表型的關系及相關機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2019年01月至2019年12月本院68 例子宮內膜癌手術患者，根據臨床和病理標準取腫瘤組織及癌旁組織，手術患者一般信息（年齡、BMI 及分型）：平均年齡（52.73±6.48）歲；BMI 指數（25.08±5.15）；雌激素依賴型38 例，非雌激素依賴型30 例。本方案通過了本院倫理委員會，患者或家屬均已簽署知情同意書。

1.2 材料與試劑

HEC-151、KLE 人子宮內膜癌細胞系及人胚胎腎細胞293T（美國ATCC）。CCK-8 試劑盒：Hyclone（美國）。轉染脂質體LipofectamineRNAiMAX Reagent：Thermo Scientific（美國）。ASF1B過表達載體及空白載體、siFOXM1、siASF1B 及siRNA 對照載體：吉凱基因（上海）。RNA 提取試劑RNAiso Reagent、RNA 逆轉錄試劑盒及SYBR Green 核酸熒光染料：Takara（日本）。一抗FOXM1（ab207298，100 μL）、CDK6（ab124821，100 μL）及VEGFB（ab51867，100 μL）：Abcam（美國）等。多孔酶標儀（Molecular Devices，型號：SpectraMax Paradigm）、凝膠成像儀（Bio-Rad，型號：GelDocEZ）、Real-time PCR 儀（Bio-Rad，型號：CFX96）。

1.3 子宮內膜癌細胞的培養及傳代

培養子宮內膜癌HEC-151 細胞在25 cm2培養瓶中，采用DMEM/F12 培養基＋10%FBS+1%青霉素-鏈霉素溶液培養，于37℃+5% CO2培養箱中培養。傳代時使用胰蛋白酶消化，1∶3 傳代并繼續培養，選取對數生長期的細胞用作后續實驗。

1.4 實驗設計分組

HEC-151 細胞分為：對照組、過表達組及回復組。對照組轉染空白對照載體+siRNA 對照載體；過表達組轉染ASF1B 過表達載體+siRNA 對照載體，回復組共轉染ASF1B+siFOXM1。KLE 細胞分為：無意義組及干擾組，無意義組轉染siRNA對照載體，干擾組轉染siRNA 靶向ASF1B 載體。

1.5 Transwell 檢測各組細胞侵襲遷移能力

取Matrigel 膠鋪于Transwell 上室面，DMEM/F12 無血清培養基水化。鋪Matrigel 膠的Transwell小室作為侵襲模型，未鋪膠的作為遷移模型。100 μL 的各組細胞懸液接種于上室面。24 h 后棉簽輕輕擦掉上室面的細胞，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結晶紫染色，進行細胞計數并進行統計學分析。

1.6 CCK-8 檢測各組細胞增殖能力

各組細胞均以每孔2 000 個接種至96 孔板中，用DMEM/F12 培養基+10%FBS+1%青霉素-鏈霉素溶液培養，在培養0、24、48、72 及96 h 時，每孔加入10 μL CCK-8，孵育2 h，酶標儀檢測450 nm處吸光度（OD）。各時間點與0 h 吸光度的比值表示細胞的相對增殖能力。24 h 計算公式：［（OD24h-OD24h空白）/（OD0h-OD0h空白）］×100%，48、72和96 h 計算方法同24 h。

1.7 Western Blot 檢測各組細胞中FOXM1、CDK6及VEGFB 蛋白的表達水平

RIPA 裂解液與蛋白酶抑制劑混合后冰上裂解各組細胞，加上樣緩沖液煮沸10 min。選用β-actin 作為內參。BCA 試劑盒測定蛋白濃度，同時選取20 μL 的目的蛋白先進行β-actin 抗體的電泳（一抗濃度1∶400），比較各組之間的灰度值，調整后進行FOXM1、CDK6 及VEGFB 的電泳。200 mA 90 min 濕轉至PVDF 膜，TBSTw 封閉液封閉1 h，一抗4℃過夜，二抗37℃1 h，發光液曝光顯影。

1.8 qPCR 檢測各組組織或細胞中ASF1B、FOXM1、CDK6 及VEGFB 的表達含量

使用TRIzol 提取各組細胞或組織中的Total-RNA，提取完成后檢測RNA 純度后。參考逆轉錄試劑盒說明書（Roche），將提取后的RNA 進行逆轉錄，得到cDNA 產物。根據SYBR GREEN 試劑盒說明（Roche），進行PCR 反應，β-actin 作為內參，并進行定量分析，目的基因的引物如表1所示。

表1 β-actin、ASF1B、FOXM1、CDK6 及VEGFB 引物序列Table 1 Primer sequences of β-actin，ASF1B，FOXM1，CDK6 and VEGFB

1.9 統計學方法

采用SPSS 23.0 軟件進行統計學分析；計量資料采用（±s）表示，兩組間比較采用單因素方差分析及Student-Newman-Keuls（SNK）；計數資料比較采用卡方檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生物信息學分析ASF1B 在子宮內膜癌中的表達情況及與患者病理資料的關系

利用UALCAN 數據庫發現，ASF1B 基因在子宮內膜癌中表達顯著增高（圖1A、B），且ASF1B 表達隨著患者TNM 分期增高而增加（圖1C），高表達ASF1B 與患者漿液性宮頸癌亞型及TP53 突變密切相關（圖1D、E）。

2.2 生物信息學分析ASF1B 與FOXM1 及子宮內膜癌患者預后的關系

ASF1B 的表達與TP53 下游分子FOXM1 的表達正相關（圖2A、B），預后分析發現ASF1B 的高表達不利于患者預后（圖2C）。

2.3 ASF1B 在68 例子宮內膜癌患者的腫瘤組織及癌旁組織中的比較及其與患者臨床資料的關系

ASF1B 高表達與腫瘤分期及淋巴結轉移的發生顯著正相關（P＜0.05），而與病理類型及分化程度無顯著相關（P＞0.05）。ASF1B 在子宮內膜癌組織中呈高表達趨勢，與其在癌旁正常組織的表達水平相比，差異有統計學意義（P＜0.01），見表2，圖3。

表2 ASF1B mRNA 表達與患者臨床資料的關系［n（%）］Table 2 The relationship between asf1b mRNA expression and clinical data of patients［n（%）］

2.4 各組細胞侵襲遷移能力及其比較

相比對照組，過表達組細胞體外轉移能力顯著增強；而相比過表達組，回復組細胞體外轉移能力顯著減弱；相比無意義組，干擾組細胞體外轉移能力顯著減弱。差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4。

2.5 各組細胞增殖能力及其比較

相比對照組，過表達組細胞體外增殖能力在48～96 h 顯著增強；而相比過表達組，回復組細胞體外增殖能力在48～96 h 顯著減弱；相比無意義組，干擾組細胞體外增殖能力在48～96 h 顯著減弱。差異有統計學意義（P＜0.05），見圖5。

2.6 各組細胞ASF1B、FOXM1、CDK6 及VEGFB的表達及其比較

過表達組細胞ASF1B、FOXM1、CDK6 及VEGFB 的蛋白表達均顯著高于對照組；而回復組細胞FOXM1、CDK6 及VEGFB 的蛋白表達均顯著低于過表達組；干擾組細胞FOXM1、CDK6 及VEGFB 的蛋白表達均顯著低于無意義組。差異有統計學意義（P＜0.05），見圖6。

2.7 各組細胞FOXM1、CDK6 及VEGFB 的基因表達含量

過表達組細胞FOXM1、CDK6 及VEGFB 的mRNA 表達顯著高于對照組；而回復組細胞FOXM1、CDK6 及VEGFB 的mRNA 表達均顯著低于過表達組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3；干擾組細胞FOXM1、CDK6 及VEGFB 的mRNA表達均顯著低于無意義組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。

表3 HEC-151 細胞FOXM1、CDK6 及VEGFB 的基因表達含量Table 3 Gene expression levels of FOXM1，CDK6 and VEGFB in HEC-151 cells

表4 KLE 細胞FOXM1、CDK6 及VEGFB 的基因表達含量Table 4 Gene expression levels of FOXM1，CDK6 and VEGFB in KLE cells

3 討論

抗沉默功能1（ASF1）作為H3/H4 組蛋白伴侶蛋白，參與細胞分裂過程中染色質重塑，并被報道與多種疾病密切相關［7］。有研究指出，過表達ASF1B 可促進腎透明細胞癌細胞的增殖與遷移，與AKT/P70 S6K1 通路的調控密切相關［6］；下調ASF1B 可抑制PI3K/AKT 通路，從而誘導癌細胞凋亡［5］；ASF1B 和組蛋白H3.3A 相互作用可刺激腫瘤細胞增殖［8］。因此，ASF1B 可能作為潛在的腫瘤靶標參與多種惡性腫瘤的發生發展。前期通過生物信息手段發現ASF1B 與已知的原癌基因FOXM1 在子宮內膜癌中表達顯著相關，而FOXM1 的表達是腫瘤組織復發和耐藥的關鍵因素［9］，下調FOXM1 的表達可降低腫瘤細胞的活性［10］。這提示ASF1B 可能通過調控FOXM1 在子宮內膜癌中發揮生物學作用。

考慮到ASF1B 在子宮內膜癌中可能的生物學價值，研究通過生物信息技術及臨床組織驗證發現，ASF1B 在子宮內膜癌組織中高表達，且與患者高臨床分期、淋巴結轉移及預后不良相關，這提示ASF1B 可能參與子宮內膜癌的發生發展。同時，生物信息學技術分析顯示原癌基因FOXM1 與ASF1B 表達在子宮內膜癌中高度正相關，提示ASF1B 可能通過調控原癌基因FOXM1 在子宮內膜癌中發揮生物學作用，進一步的體外研究顯示，ASF1B 對FOXM1 及其下游分子CDK6 及VEGFB 存在正調控作用，且可顯著促進細胞增殖及轉移能力，回復性干擾FOXM1 則顯著抑制ASF1B 過表達后的生物學效應，干擾ASF1B 則可抑制FOXM1 及其下游通路，并減弱細胞增殖及轉移能力，這些證據表明ASF1B 能有效介導FOXM1 的表達，從而促進子宮內膜癌細胞的惡性表型。

綜上所述，ASF1B 在子宮內膜癌的發生與發展中發揮著重要作用，其可通過增強FOXM1 的表達促進子宮內膜癌細胞的惡性表型。本研究結論為子宮內膜癌的治療提供了新的干預靶點。雖然本研究在細胞水平證實ASF1B 與FOXM1 在子宮內膜癌細胞惡性表型中的作用，但干擾ASF1B 與FOXM1 可以作為子宮內膜癌的治療策略仍需通過動物實驗進一步明確，最終可推廣于臨床診斷與治療中［11］。