hrHPV E6/E7 mRNA載量水平與宮頸癌前病變的相關性分析

郭晨輝 徐小晶 孔薇 項敏

宮頸癌前病變即宮頸上皮內瘤樣病變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）是有癌變傾向，在數年至數十年期間有可能發展為宮頸癌的病變［1-2］。已有研究顯示［3-4］，高危型人乳頭瘤病毒（high-risk human papillomavirus，hrHPV）持續感染是導致宮頸癌變的主要危險因素，宮頸癌患者中hrHPV 陽性率高達85%～90%。HPV 基因組包括早期區、晚期區和非編碼區，其中早期區基因E6 和E7 可以參與病毒自身的復制、轉錄、翻譯等過程，在宮頸癌變中發揮了最主要的作用，可用于宮頸癌的鑒別診斷［5］。既往研究采用定性檢測分析了hrHPV E6/E7 mRNA陽性表達與CIN 和宮頸癌之間的關系，及其對CIN和宮頸癌的鑒別診斷［6］。但hrHPV E6/E7 mRNA 載量對CIN 的診斷價值，及其與CIN 病變程度之間的關系報道較少。因此，本研究定量分析了hrHPV E6/E7 mRNA 載量與CIN 病變之間的關系，旨在為宮頸癌的預防和治療提供一定的理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2016年12月到2019年6月本院確診的176 例宮頸病變患者，其中CIN 組144 例，宮頸癌組32例。CIN 組患者年齡25～60 歲，平均（40.87±7.62）歲，經產婦98 例，未產婦46 例，根據CIN 分級［7］：CINⅠ級62 例，CINⅡ級45 例，CINⅢ級37 例。宮頸癌組患者年齡28～60 歲，平均（42.53±8.46）歲，經產婦24 例，未產婦8 例。另取同期50 例慢性宮頸炎患者為慢性宮頸炎組，年齡25～60 歲，平均（40.54±8.21）歲，經產婦32 例，未產婦18 例。3 組間的年齡、經產次比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

納入標準：均經陰道鏡下組織病理學檢查和宮頸液基薄層細胞學（thinprep cytology test，TCT）檢測確診，符合《宮頸癌防治指南》中CIN 和宮頸癌的診斷標準［8］；均未經接受過放化療治療，經醫院倫理委員會審核通過。排除標準：妊娠期、月經期或哺乳期患者；存在宮頸手術史；入組前2 周內服用相關抗病毒藥物；合并其他系統惡性腫瘤患者；合并其它免疫系統疾病者；臨床資料不完整者。

1.2 方法

①檢查前3 d 不能性生活、陰道用藥或陰道沖洗，避開月經期。將TCT 專用刷伸入子宮頸內，順時針旋轉3～5 周，收集宮頸脫落上皮細胞，置于采樣瓶中，用于TCT、hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7mRNA 檢測。②TCT 檢測：使用全自動細胞制片機制片，參考2001年TBS 分級系統［9］，包括NSIL：無上皮病變或惡性改變；ASC-H：不典型鱗狀細胞；ASC-US：意義不明的非典型鱗狀細胞；LSIL：低級別鱗狀CIN；HSIL：高級別鱗狀CIN；SCC：鱗狀細胞癌。③hrHPV DNA 檢測：采用第二代捕獲雜交法（hybrid capture-Ⅱ，HC-Ⅱ）（美國凱杰公司）檢測13 種hrHPV DNA 表達，相對光單位/臨床閾值（relative light units/cut off，RLU/CO）表示HPV 病毒載量，重復檢測2 次取均值。④hrHPV E6/E7 mRNA 檢測：采用支鏈DNA（Branched-DNA，bDNA）信號擴增法（科蒂亞生物技術公司）檢測14 種hrHPV E6/E7 mRNA 水平，嚴格按照試劑盒說明操作。重復檢測2 次取均值。

1.3 統計學處理

采用SPSS 22.0 軟件對數據進行分析，滿足正態分布的計量資料均以（±s）表示，單因素方差分析比較多組間差異，SNK-q比較多組兩兩間差異；ROC 分析hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA載量對CIN 的診斷價值；Pearson 相關性分析hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA 載量與CIN 病變程度之間的相關性；P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組患者的hrHPV E6/E7mRNA 和hrHPV DNA 載量比較

CIN 組和宮頸癌組患者的hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 載量高于慢性宮頸炎組（P＜0.05），CIN 組患者的hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 載量低于宮頸癌組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組患者的hrHPV E6/E7mRNA 和hrHPV DNA載量比較（±s）Table 1 Comparison of hrHPV E6/E7mRNA and hrHPV DNA load in each group（±s）

表1 各組患者的hrHPV E6/E7mRNA 和hrHPV DNA載量比較（±s）Table 1 Comparison of hrHPV E6/E7mRNA and hrHPV DNA load in each group（±s）

注：與慢性宮頸炎組相比，aP＜0.05；與宮頸癌組相比，bP＜0.05。

組別CIN 組宮頸癌組慢性宮頸炎組F 值P 值n 144 21 50 hrHPV DNA［lg（RLU/CO）］1.76±0.55ab 2.12±0.70a 1.44±0.46 14.871＜0.001 hrHPV E6/E7 mRNA［lg（copies/mL）］3.04±0.96ab 4.21±1.34a 1.86±0.61 60.372＜0.001

2.2 hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA 載量對CIN 的診斷價值

hrHPV E6/E7 mRNA 在CIN 與慢性宮頸炎鑒別診斷中AUC 為0.816，95%CI為0.719～0.913，具有統計學意義（P＜0.05），hrHPV DNA 載量在CIN與慢性宮頸炎鑒別診斷中AUC 為0.561，無統計學意 義（P＞0.05）；hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA 載量在CIN 與宮頸癌鑒別診斷中AUC 分別為0.736 和0.698，95%CI分別為0.664～0.808 和0.615～0.780，具有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

2.3 hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA 載量與宮頸細胞學TBS 分級的關系

隨著TBS 分級增加，hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 載量呈升高趨勢（P＜0.05），HSIL 組和宮頸癌組的hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA載量高于ASC 組、LSIL 組和NSIL 組；ASC 組和LSIL 組 的hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 載量高于NSIL 組（P＜0.05）。宮頸癌組和HSIL 組間差異無統計學意義（P＞0.05），ASC 組和LSIL 組間差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA 載量與TBS 分級的關系（±s）Table 2 relationship between hrHPV E6/E7 mRNA and hrHPV DNA load and TBS grading（±s）

表2 hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA 載量與TBS 分級的關系（±s）Table 2 relationship between hrHPV E6/E7 mRNA and hrHPV DNA load and TBS grading（±s）

注：與NILM 相 比，aP＜0.05；與ASC 相比，bP＜0.05；與LSIL 相比，cP＜0.05。

TBS 分級NILM ASC LSIL HSIL SCC F 值P 值n 90 24 59 32 21 hrHPV DNA［lg（RLU/CO）］1.40±0.38 1.77±0.56a 1.82±0.57a 2.21±0.72abc 2.25±0.71abc 87.274＜0.001 hrHPV E6/E7 mRNA［lg（copies/mL）］1.65±0.52 3.42±1.08a 3.54±1.12a 4.21±1.24abc 4.33±1.40abc 146.539＜0.001

2.4 hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA 載量與CIN 病變程度的關系

隨著CIN 分級增加，hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 載量呈升高趨勢（P＜0.05），CINⅢ級患者的hrHPV E6/E7 mRNA 載量高于CINⅠ和CINⅡ期（P＜0.05），CINⅡ級的hrHPV E6/E7 mRNA 載量高于CINⅠ（P＜0.05），見表3。

表3 hrHPV E6/E7mRNA 和hrHPV DNA 載量與CIN 病變程度的關系（±s）Table 3 relationship between hrHPV E6/E7mRNA and hrHPV DNA load and the degree of CIN lesions（±s）

表3 hrHPV E6/E7mRNA 和hrHPV DNA 載量與CIN 病變程度的關系（±s）Table 3 relationship between hrHPV E6/E7mRNA and hrHPV DNA load and the degree of CIN lesions（±s）

注：與CINⅠ級相比，aP＜0.05；與CINⅡ級相比，bP＜0.05。

CIN 分級CIN Ⅰ級CIN Ⅱ級CIN Ⅲ級）F 值P 值n 62 45 37 hrHPV DNA［lg（RLU/CO）］1.52±0.48 1.78±0.53a 2.03±0.65ab 10.460＜0.001 hrHPV E6/E7 mRNA［lg（copies/mL）］2.01±0.62 3.24±1.02a 4.12±1.13ab 66.826＜0.001

2.5 hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA 載量與CIN 病變程度之間的相關性關系

Pearson 相關性分析顯示，hrHPV E6/E7 mRNA和hrHPV DNA 載量均與CIN 病變程度呈正相關（r=0.285，0.621；P＜0.05）。

3 討論

CIN 是宮頸非典型增生，hrHPV 持續感染是導致CIN 發展為宮頸癌的最主要因素。既往研究常采用hrHPV 感染來輔助臨床宮頸癌的篩查，靈敏度高，可以作為宮頸癌初篩工具之一［10］。然而近年來研究顯示［11］，只有宮頸上皮細胞的hrHPV 持續性感染可能誘發宮頸癌變，而單純一過性hrHPV 感染很難誘導宮頸惡性腫瘤的形成。hrHPV 持續感染受HPV 病毒的亞型、癌基因活躍程度、宿主免疫應答等多種因素影響，單純的hrHPV 檢測無法區分hrHPV 的感染狀態，對于宮頸病變的診斷、嚴重程度評估具有一定的局限性［12］。HPV 基因組的調控功能主要由E 區基因（E1、E2、E4、E5、E6 和E7）編碼，其中E6 基因編碼的E6 蛋白可以調節癌基因p53 的表達，發揮致癌作用，而E7 基因編碼的蛋白可以降解Rb，釋放E2F 轉錄因子，誘導細胞惡性增殖［13］。Fan 等的研究顯示［14］，E6/E7 基因的轉錄、翻譯是調節HPV 感染誘導宮頸癌變的重要基因，可以反映病毒癌基因的活性，在宮頸癌篩查中具有重要的應用價值。因此，本研究定量分析了hr-HPV E6/E7 mRNA 載量與CIN 病變之間的關系，旨在準確評估CIN 的發生發展，預防宮頸癌變的發生。

本研究中，CIN 組患者的hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 水平明顯高于慢性宮頸炎組，且低于宮頸癌組，提示hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 水平與患者的宮頸癌變有關，有望應用于臨床診斷。本研究中，隨著TBS 分級增加，hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 載量呈上升趨勢。TBS 分級是一種基于宮頸/陰道細胞學的診斷技術，根據宮頸細胞病變程度進行分級，在宮頸癌篩查中具有較高的特異性，但敏感性較低［15］。本研究結果提示hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 載量與宮頸細胞病變程度有關，有望應用于臨床宮頸病變的評估。

綜上所述，hrHPV E6/E7 mRNA 對CIN 具有較高的診斷價值，且mRNA 載量與CIN 分級具有顯著的相關性，可以用于CIN 的鑒別診斷和病變評估，指導臨床預防和治療工作的進行。本研究不足之處在于樣本數量較少，且為單中心研究，可能會對結果產生一定的統計學誤差，但本研究仍為CIN 的診斷和防治提供了一定的理論依據。