外周血miR-23b-3p表達水平對重癥肺炎患兒病情及預后的評估價值

吳英 劉成桂

肺炎是兒科常見的感染性疾病，部分患兒可進展至重癥肺炎，病情危重且進展迅速、并發癥多，臨床預后較差、死亡率較高［1］。在臨床實踐中，準確評估重癥肺炎的病情及預后對指導治療具有重要意義，但目前臨床上常用的肺炎評價指標白細胞計數（WBC）、C 反應蛋白（CRP）、血沉（ESR）等存在特異性不強的缺點。另外，急性生理和慢性健康狀況II（acute physiology and chronic health evaluationII，APACHEII）評分雖然在病情評估中展現出積極價值［2-3］，但評價過程較為繁瑣，不利于在早期評估病情和預后。微小RNA（microRNA，miR）是近些年呼吸系統疾病研究的熱點分子，國內戴彩同［4］關于肺炎的基礎研究發現miR-23b-3p與肺炎的發病有關。因此，本研究將以重癥肺炎患兒為對象，具體分析外周血miR-23b-3p 表達水平對病情及預后的評估價值。

1 資料與方法

1.1 資料

選擇2017年6月至2019年12月期間本院收治的180 例肺炎患兒，將76 例重癥肺炎患兒作為重癥肺炎組，其中男性40 例、女性36 例，年齡（5.58±1.02）歲；104 例普通肺炎患兒作為普通肺炎組，其中男性59 例、女性45 例，年齡（6.11±1.21）歲；另取同期體檢的80 例健康兒童作為對照組，其中男性45 例、女性35 例，年齡（6.02±0.94）歲。3 組間一般資料的比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具可比性。

入組標準：①符合《兒童社區獲得性肺炎管理指南（2013 修訂）》中相關的診斷標準［5］；②留取外周抗凝血及血清樣本；③臨床資料完整。排除標準：①合并支氣管哮喘、支氣管肺發育不良；②合并先天性疾病；③長期使用激素或免疫抑制藥物。

1.2 外周血miR-23b-3p 表達的檢測

取三組受試者的外周抗凝血樣本，首先采用全血miR 提取試劑盒（北京天根公司）分離外周血中的miR，而后采用miR 反轉錄試劑盒（北京天根公司）將外周血中的miR 反轉錄為cDNA，最后采用miR 熒光定量PCR 檢測試劑盒（北京天根公司）配置PCR 反應體系：cDNA 樣本1 μL、PCR 混合液10 μL、10 μmol/L 上下游引物各0.4 μL、去離子水補足至20 μL，所用引物分別為miR-23b-3p 及內參U6 的特異性引物。在熒光定量PCR 儀上按照94℃預變性2～3min 后94℃15 s、60℃40 s 重復40個循環的程序完成PCR 反應，生成反應的循環曲線及循環閾值（Cycle threshold，Ct），以U6 為內參，計算miR-23b-3p 的表達水平。

1.3 血清炎癥因子含量的檢測

取三組受試者的血清樣本，采用酶聯免疫吸附法試劑盒（上海酶聯公司）檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）的含量的含量，均按照試劑盒說明書進行檢測操作。

1.4 重癥肺炎患兒預后的評估

追蹤重癥肺炎患兒的病歷資料，根據28 d 生存情況評估預后，結局包括生存及死亡。

1.5 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件進行數據統計，計量資料（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析、生存情況的比較通過繪制KM曲線并進行Log-rank 檢驗，miR-23b-3p 預測預后采用ROC 曲線分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組受試者外周血miR-23b-3p表達水平的比較

3 組受試者外周血miR-23b-3p 表達水平的比較結果：對照組＞普通肺炎組＞重癥肺炎組，差異有統計學意義（P＜0.05）；對照組與普通肺炎組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3 組受試者外周血miR-23b-3p 表達水平比較（±s）Table 1 Comparison of miR-23b-3p expression in peripheral blood of 3 groups（±s）

表1 3 組受試者外周血miR-23b-3p 表達水平比較（±s）Table 1 Comparison of miR-23b-3p expression in peripheral blood of 3 groups（±s）

組別重癥肺炎組普通肺炎組對照組F 值P 值n 76 104 80 miR-23b-3p 0.60±0.21 0.89±0.25 0.96±0.22 94.520 0.000

2.2 重癥肺炎組中不同miR-23b-3p 表達患兒實驗室指標及APACHEII 評分的比較

與重癥肺炎組中高miR-23b-3p 表達患兒比較，低miR-23b-3p 表達患兒WBC、ESR、CRP 水平及APACHEII 評分均明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 重癥肺炎組中不同miR-23b-3p 表達患兒血清炎癥因子含量的比較

與重癥肺炎組中高miR-23b-3p 表達患兒比較，低miR-23b-3p 表達患兒血清TNF-α、IL-6、IL-10 的含量明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表2 重癥肺炎組中不同miR-23b-3p 表達患兒實驗室指標及APACHEII 評分的比較（±s）Table 2 Comparison of laboratory indexes and APACHE II scores of children with different miR-23b-3p expression in severe pneumonia group（±s）

表2 重癥肺炎組中不同miR-23b-3p 表達患兒實驗室指標及APACHEII 評分的比較（±s）Table 2 Comparison of laboratory indexes and APACHE II scores of children with different miR-23b-3p expression in severe pneumonia group（±s）

miR-23b-3p 表達低表達高表達t 值P 值n 38 38 WBC(×109/L)17.27±3.72 12.55±3.02 6.072 0.000 ESR(mm/h)45.49±8.39 36.62±6.41 5.179 0.000 CRP(mg/L)62.32±11.35 49.83±10.44 4.993 0.000 APACHEII 評分(分)16.47±3.21 12.45±2.26 6.312 0.000

表3 重癥肺炎組中不同miR-23b-3p 表達患兒血清炎癥因子含量的比較（±s）Table 3 Comparison of serum inflammatory factors between children with different expression of miR-23b-3p in severe pneumonia group（±s）

miR-23b-3p表達低表達高表達t 值P 值n 38 38 TNF-α（ng/mL）52.39±9.39 43.11±8.37 4.548 0.000 IL-6（ng/mL）104.58±22.54 81.47±16.58 5.091 0.000 IL-10（pg/mL）86.68±13.47 65.47±11.09 7.493 0.000

2.4 重癥肺炎組中不同miR-23b-3p 表達患兒28天生存情況的比較

繪制重癥肺炎組患兒28 天生存情況的KM曲線并進行Log-rank 檢驗，與重癥肺炎組中高miR-23b-3p 表達患兒比較，低miR-23b-3p 表達患兒28 天累積生存率明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

2.5 miR-23b-3p 預測重癥肺炎患兒28 天生存的ROC 曲線分析

繪制miR-23b-3p 預測重癥肺炎患兒28 天生存的ROC 曲線，曲線下面積為0.6818（95%CI：0.5522～0.8115、P=0.013），根據約登指數最大值確定最佳截斷值為0.575，該截斷值預測28 天生存的靈敏度為72.73%、特異性為57.14%。見圖2。

3 討論

重癥肺炎是兒科常見的危重癥，具有臨床救治難度大、病情發展快、預后差、死亡率較高的特點。多項重癥肺炎相關的臨床研究發現，高效價血漿治療、支氣管鏡肺泡灌洗術等手段能夠改善患兒預后、降低死亡率［6-7］。因此，準確判斷重癥肺炎的病情嚴重程度及預后能夠為預后不良患兒的早期篩查提供依據，針對預后不良高危患兒開展高效價血漿治療、支氣管鏡肺泡灌洗術等治療預期能夠改善預后。但目前臨床常用的肺炎評估指標WBC、CRP、ESR 等的特異性較差、對預后評估的效能也較弱，急需尋找重癥肺炎新的病情及預后評估標志物。

miR 是近些年呼吸系統疾病研究的熱點，具有廣泛的生物學作用，參與體內炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡等多種生物學環節的調控。多種miR在肺炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病動物模型及臨床患者中的表達均發生改變［8-11］。miR 是一種非編碼小分子RNA，能夠在轉錄后水平調節基因表達，進而產生相應的生物學效應，如抗炎、抗氧化、抗凋亡等。miR-23b-3p 是目前已知的一種具有明確抗炎活性的miR。另有膿毒癥相關的細胞實驗發現miR-23b-3p 能夠抑制膿毒癥誘導的THP-1 細胞及心肌細胞炎癥反應［12-13］。

根據國內戴彩同［4］的細胞實驗研究，肺炎鏈球菌感染能夠抑制肺泡上皮細胞中miR-23b-3p 的表達，與本研究發現的重癥肺炎患兒外周血中miR-23b-3p 低表達的趨勢一致；過表達miR-23b-3p 后，肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞IL-6、IL-10 釋放明顯減少。在重癥肺炎的發病過程中，體內炎癥反應顯著激活、多種炎癥細胞因子大量釋放，已有研究報道重癥肺炎患者血清中TNF-α、IL-6、IL-10的含量均明顯增加且與病情嚴重程度有關［14-17］。

APACHEII 評分是目前臨床上評估重癥肺炎病情及預后的有效方法，但該量表需要根據入院后24h 內的各項生命體征及輔助檢查進行評分，過程復雜且無法早期評估病情及預后。本研究在發現重癥肺炎患兒外周血miR-23b-3p 表達降低且與病情加重、炎癥激活有關后，進一步觀察了miR-23b-3p 對預后的評估價值，通過觀察28 天生存情況來反映預后，經KM 曲線分析可知：隨著外周血miR-23b-3p 表達減少，重癥肺炎患兒的累積生存率明顯降低，表明miR-23b-3p 低表達與重癥肺炎患兒預后惡化有關；經ROC 曲線分析，miR-23b-3p 表達對重癥肺炎患兒的28 天生存情況具有預測價值，由此提示檢測miR-23b-3p 能夠為重癥肺炎患兒預后的評估提供依據。

本研究的以上結果表明，重癥肺炎患兒外周血高miR-23b-3p 低表達與病情加重、炎癥反應激活有關，同時也對28 天生存預后具有評估價值，但本研究的樣本量較少、今后可繼續收集臨床病例來驗證miR-23b-3p 在重癥肺炎患兒病情及預后評估中的價值，也可設計動物實驗來驗證miR-23b-3p在重癥肺炎發病過程中的抗炎及保護作用。