肺癌患者血清miRNA-4534水平和病理分期與預后的關系

楊壽艷 鄧彬兵 孟雄 王兮 母前途

由于發現時多數肺癌患者已至中晚期、腫瘤細胞易耐藥及腫瘤生物學行為復雜等原因，多數肺癌患者生存期較短［1］。微小核糖核苷酸（micro RNA，miRNA）是一種長度較短的單鏈RNA，它能夠通過結合miRNA 的3′-端非編碼區來調節靶基因的表達［2］。目前已知與肺癌相關的miRNA 有約40 種，與肺癌的發生、診斷、耐藥性，治療等方面有重要關聯［3］。此前有研究通過深度測序，觀察到miR-4534 在正常和惡性人類β 細胞中表達有差異［4］。然而，微小核糖核苷酸-4534（microRNA-4534，miRNA-4534）在肺癌患者中的表達、作用等尚不明確。基于此，本研究選取64 例肺癌患者作為研究對象，以探討肺癌患者血清miRNA-4534 水平和病理分期與預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月至2016年6月間收治的64 例肺癌患者作為研究對象。肺癌患者納入標準：①均經病理檢查確診為肺癌者，且均為原發肺癌患者［5］；②入組前未經放化療、手術等抗癌治療；③初發肺癌者；④年齡＞18 歲者。排除標準：①合并其他惡性腫瘤者；②合并其他重要器官功能障礙。良性肺病者30 例包括肺炎14 例、肺結核8 例、炎性假瘤8 例，肺癌組：男性41 例、女性23 例，年齡39-85歲、平均年齡（60.52±9.50）歲。良性肺病組：男性17例、女性13 例，年齡34-72 歲、平均年齡（60.13±8.20）歲。選取同期體檢健康志愿者30 例作為對照組，其中男性18 例、女性12 例，年齡27 歲～70 歲、平均年齡（60.84±6.74）歲。三組一般資料對比，差異無統計學意義（P＞0.05）。所有患者均已取得知情同意，本研究已通過醫院倫理委員會審核。

1.2 檢測方法

使用檸檬酸鈉抗凝管收集所有研究對象的外周血3 mL，4 ℃下放置，1 h 內3 000 r/min 離心10 min，收集上清液，-80℃凍存待測。使用Trizol 提取試劑（美國Invitrogen 公司，批號：1420087）從血清中提取總RNA，并使用反轉錄技術將其反轉錄為cDNA（反轉錄試劑盒購自日本Takara 公司，批號：RR047A），使用SYBR premix EX taq 試劑盒進行樣品上樣，然后在實時聚合酶鏈式反應（PCR）儀中對樣品進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR，試劑盒購自日本Takara 公司，實時PCR 儀為美國ABI 7500型），每個樣品設置三次重復孔。MiR-4534 的引物序列為正向引物：5′-GTGATTTATTTTTGTAAGT TTAGTATTTTGGGAG-3；反向引物：5′-ACAAA TACRTACCACCATACCCAA-3′。由日本Takara公司合成，U6 引物序列為正向引物：5′-CTCGCTT CGGCAGCACA-3′；反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。作為內參反應體系，使用2-ΔΔCt法計算miRNA 的相對表達量。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0 統計軟件進行數據分析，偏態分布計量資料以（±s）表示，偏態分布計量數據以中位數［四分位間距（p25，p75）］表示，兩組間對比行獨立t檢驗或Mann-Whitney U 檢驗，多組間對比行Kruskal-Walls H（k）檢驗；計數資料以n（%）表示，行χ2檢驗；繪制ROC 曲線評估miRNA-4534診斷肺癌發病及患者預后不良的效能，采用pearson 法分析mirRNA-4534 與患者生存期的關系，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組間miRNA-4534 相對表達量對比

肺癌組miRNA-4534 相對表達量高于良性肺病組和對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），良性肺病組和對照組miRNA-4534 相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 3 組間miRNA-4534 相對表達量對比Table 1 Comparison of relative expression level of miRNA-4534 among the 3 groups

2.2 miRNA-4534 診斷肺癌的ROC 曲線

ROC 曲線顯示，miRNA-4534 診斷肺癌發病的曲線下面積（AUC）為0.839（95%CI：0.777～0.931，P＜0.05），最佳臨界值為2.52，敏感性76.56%，特異性98.33%，見圖1。

2.3 miRNA-4534 相對表達量與肺癌臨床病理特征的關系

不同性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、病理類型間miR-4534 相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05），TNM Ⅲ/Ⅳ期肺癌患者miR-4534 相對表達量高于Ⅰ/Ⅱ期者，差異有統計學意義（P＜0.05），有淋巴結轉移肺癌患者miR-4534 相對表達量高于無淋巴結轉移者差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 miRNA-4534 相對表達量與肺癌臨床病理特征的關系Table 2 Correlation between relative expression of miRNA-4534 and clinicopathological features of lung cancer

2.4 隨訪情況

隨訪3年，肺癌組64 例患者獲得隨訪資料者62 例，失訪率3.13%（2/64）。62 例患者中3年生存25 例、生存率40.32%（25/62），總生存時間（26.27±9.92）個月。

2.5 miRNA-4534 與肺癌預后的關系

高表達組3年生存率、生存時間均低于低表達組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3、圖2。

表3 miRNA-4534 與肺癌預后的關系Table 3 Correlation between miRNA-4534 and prognosis of lung cancer

2.6 miRNA-4534 診斷肺癌預后不良的ROC 曲線

以隨訪3年內死亡作為預后不良繪制ROC 曲線，miRNA-4534 診斷預后不良AUC 為0.914（95%CI：0.814～0.970，P＜0.05），最佳臨界值為15.69。見圖3。

2.7 miRNA-4534 與肺癌患者生存期的相關性分析

Pearson 相關分析法顯示：miRNA-4534 水平與肺癌患者生存期呈負相關關系（r=-0.386，P=0.002）。

3 討論

單個miRNA 表達變化與腫瘤演進過程有緊密關聯，通常miRNA 可在腫瘤患者血液中被檢測出異常表達，且不易被RNA 酶降解破壞，這使得血液miRNA 成為無創檢查手段熱門生物標志群［5］。miRNA-4534 位于染色體22q13.1，有研究報道該miRNA 與前列腺癌侵襲性相關，通過調節血管生成抑制蛋白-1（VASH-1），促進前列腺癌的發展［6］。miRNA-4534 目前研究較少，尤其是在肺癌患者中。研究顯示，VASH-1 可能參與非小細胞肺癌患者腫瘤血管的形成機制，進而促進肺癌的生長、侵襲和轉移［7-8］。因此，miRNA-4534 可能也是與肺癌相關的基因，本研究探討血清miRNA-4534在肺癌患者中的表達及其臨床意義。

本研究結果顯示，肺癌組miRNA-4534 相對表達量明顯高于良性肺病和對照組，這與miRNA-4534 在前列腺癌、黑色素瘤等表達特點相似［6，9］。miRNA-4534 這一表達特點，提示其有可能作為肺癌患者的診斷指標。本研究數據顯示，miRNA-4534 診斷肺癌發病效能良好；性別、年齡、腫瘤大小、病理類型及吸煙史與miRNA-4534 相對表達量無關；miRNA-4534 可能參與肺癌進展和侵襲轉移。既往文獻指出，miRNA-4534 作為致癌基因，其衰減可導致癌細胞的細胞周期停滯、凋亡，遷移侵襲能力和集落形成能力減弱［10］。嚴淑等［9］學者的研究顯示，miRNA-4534 能通過靶基因第10 號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因（PTEN），參與人黑色素瘤的侵襲轉移。而非小細胞肺癌組織中的PTEN 蛋白確實與肺癌的發生發展有關［11-12］。

PTEN 是具有磷酸酶活性的抑癌基因，可抑制磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）對下游靶蛋白的磷酸化作用，阻斷蛋白激酶B（Akt）活化，抑制p-Akt 激活下游蛋白，并誘導細胞凋亡，抑制腫瘤浸潤、轉移，是通路中的負性調節因子，PTEN 在肺癌發生發展中具有重要作用［13-14］。miRNA-4534 直接靶向PTEN 及其下游效應子，影響PTEN 的負反饋作用，因此過表達miRNA-4534 對肺癌患者產生不良影響。當然，本研究樣本量稍小，且TNM Ⅲ/Ⅳ期患者占比較多，可能會導致其結果發生偏倚。期待大樣本量研究評估miRNA-4534 對肺癌的診斷價值，尤其是早期肺癌，以進一步評估miRNA-4534的臨床應用價值。

本研究隨訪3年患者總生存率略低于胡立紅等［15］學者的研究隨訪結果。且本研究中肺癌患者TNMⅢ/Ⅳ期占比高，這可能是患者整體預后情況不佳的原因。研究還發現，miRNA-4534 高表達組與肺癌預后相關。ROC 曲線反映出miRNA-4534在肺癌預后預測中的有效性，且生存時間與miRNA-4534 有線性相關性。值得注意的是，ROC 曲線顯示miRNA-4534 診斷肺癌預后不良的最佳臨界值為15.69，有一定應用價值，也待進一步研究驗證。

綜上所述，肺癌患者血清miRNA-4534 相對表達量顯著上升，與肺癌患者TNM 分期和淋巴結轉移相關，高表達miRNA-4534 者預后更差。miRNA-4534 也是診斷肺癌患者發病和預測其預后不良的有效指標。