慢性乙型肝炎患者外周血中sFGL2檢測的臨床意義

洪曉綠 潘小平 徐沛演 黃小華

可溶性纖維介素蛋白2（soluble fibrinogen like protein 2，sFGL2）屬纖維蛋白原相關超家族，與纖維蛋白原β 鏈和γ 鏈同源，其基因定位于7q11.23，全長約7 kb，含2 個外顯子，1 個內含子［1］。sFGL2 主要是由T 淋巴細胞分泌，作為免疫抑制因子，它可抑制T 淋巴細胞和樹突狀細胞活性，介導B 淋巴細胞凋亡［2］。國內外已有研究表明，sFGL2 與胰腺炎［3］、冠心病［4］、腎細胞癌［5］等疾病相關。近年來，sFGL2在病毒性肝炎發病機制中的作用越來越受到重視，但大多研究主要以病理組織為主［6-7］，鑒于此，本文將分析sFGL2 表達變化及臨床意義，并與臨床相關指標進行相關性分析，旨在探討其預測CHB 患者臨床轉歸和預后的價值；同時深入研究sFGL2 在CHB 患者抗病毒治療前后表達變化，分析它成為CHB 患者抗病毒治療監測指標的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選取2019年8月1日～2020年1月22日在本院就診的CHB 患者140 例作為乙型肝炎病毒感染觀察組（CHB 組），男性86 例，女性54 例，平均年齡（38.96±12.07）歲。其中25 例CHB 患者依據臨床診斷需進行抗病毒治療（抗病毒治療組），男性16 例，女性9 例，平均年齡（40.65±13.41）。選取同期丙型肝炎患者42 例作為丙型肝炎病毒感染觀察組（CHC 組），男性35 例，女性7 例，平均年齡（40.95±6.24）歲。另外選取同期體檢健康人群68例作為對照組，男性26 例，女性42 例，平均年齡（36.71±12.85）。各組間年齡比較差異無統計學意義（F=2.492，P=0.116），具有可比性。

納入標準分別符合中華醫學會感染病學會分會和中華醫學會肝病學分會制定的慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）［8］或慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）［9］的診斷標準。排除標準：①乙肝及丙肝重疊感染者；②合并其他慢性肝病者；③合并肝惡性腫瘤或其他臟器惡性腫瘤者；④其他重要臟器功能不全。健康體檢志愿者未攜帶肝炎病毒。患者參與前均簽署知情同意書，本研究經本院倫理委員會審核批準。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及處理

所有受試者清晨空腹采集靜脈血5 mL 置于乙二胺四乙酸二鈉抗凝管中，抗病毒治療患者于抗病毒治療3 個月后清晨空腹另采集靜脈血5 mL置于乙二胺四乙酸二鈉抗凝管中。采血后30 min內取全血1.5 mL 置于離心管中，按照人外周血淋巴細胞分離液（碧云天生物技術，上海）說明書，提取并純化外周血單個核細胞，-80℃保存；剩余全血1 500 rpm 離心20 min，分離血漿，-80℃保存。

1.2.2 酶聯免疫吸附試驗檢測血漿sFGL2 濃度

按照人可溶性纖維介素蛋白2（sFGL2）試劑盒（科易達生物科技有限公司，廣州）說明書檢測所有受試者血漿中sFGL2 濃度，CHB 組血漿同時送本院醫學檢驗科檢測HBV-DNA、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷氨酰轉肽酶（γ-glutamyl transferase，GGT）、總膽紅素（total bilirubin，T-Bil）和甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）。

1.2.3 實時定量聚合酶鏈式反應檢測sFGL2mRNA 表達

Trizol（Invitrogen，美國）提取外周血單個核細胞總RNA 后，反轉錄為cDNA。以cDNA 為模板，用特異性引物（sFGL2-F：AGGCAGAAACGGACTGTTGT，sFGL2-R：CCAGGCGACCATGAAGTACA）進行擴增，以GAPGH（GAPGH-F：TGCACCACCAACTGCTTAGC，GAPGH-R：GGCATGGACTGTGGTCATGAG）為內參。體系如下：SYBRTMPremix 10 μL；Forward primer（10 pmol/μL）2 μL；Reverse primer（10 pmol/μL）2 μL；cDNA 3 μL；H2O 8 μL。95℃預變性2 min，然后按照以下條件執行40 個循環：95℃10 s，60℃45 s。采用2-△△Ct法計算其相對表達量，其中△CT=CT目的基因-CT內參基因，△△CT=△CT-△CT對照組最大值，每樣品重復3 次，取平均Ct 值。

1.3 統計學方法

運用SPSS 13.0 軟件進行數據分析，計量資料采用（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較F檢驗，相關性分析采用Pearson 法，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組間血漿sFGL2 濃度和sFGL2 mRNA 表達比較

3 組血漿sFGL2 濃度和sFGL2mRNA 表達水平比較：CHB 組＞CHC 組＞對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 3 組間血漿sFGL2 和sFGL2 mRNA 表達量比較（±s）Table 1 Coparing the levels of plasma sFGL2 and sFGL2 mRNA in 3 groups（±s）

表1 3 組間血漿sFGL2 和sFGL2 mRNA 表達量比較（±s）Table 1 Coparing the levels of plasma sFGL2 and sFGL2 mRNA in 3 groups（±s）

組別CHB 組CHC 組對照組F 值P 值sFGL2 濃度（ng/mL）93.59±38.96 26.08±5.14 16.68±3.39 193.449＜0.001 sFGL2 mRNA 63.44±38.96 12.09±6.70 8.24±5.94 102.275＜0.001

2.2 血漿sFGL2 和sFGL2 mRNA 表達與CHB 患者各臨床指標間的相關性分析

Spearman 分析結果表明，sFGL2 與HBV-DNA病毒載量、ALT、AST 呈正相關（P＜0.05），與GGT、T-Bil、AFP 無相關（P＞0.05），見表2。

表2 血漿sFGL2 和sFGL2 mRNA 表達與CHB 患者各臨床指標間的相關性分析Table 2 analysising the correlation between plasma sFGL2 and sFGL2 mRNA expression with clinical indexes in CHB patients

2.3 抗病毒治療前后血漿sFGL2 濃度和sFGL2 mRNA 表達比較

抗病毒治療組經3 個月抗病毒治療后血漿sFGL2 濃度和sFGL2mRNA 表達較抗病毒治療前顯著下降，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表3。

3 討論

目前，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）造成患者慢性感染的免疫學損傷機制仍不明確，T 淋巴細胞尤其是調節性T 淋巴細胞（regulatory T cell，Treg）在其發生發展進程中起關鍵作用［10］。sFGL2 主要由T 淋巴細胞分泌，是Treg 細胞活性功能不可缺少的重要調節因子，其生物學功能已成為近年來研究的熱點［11］，與肝臟相關疾病的研究也涉及其中，如COLAK 等［12］報道sFGL2 在非酒精性脂肪肝病患者中高表達；AI 等［13］報道sFGL2在自身免疫性肝炎患者活動期顯著升高，其升高程度與AIH 嚴重程度成正比；YU 等［14］報道在暴發性肝炎中sFGL2 可激活補體系統，參與疾病的發展進程。

sFGL2 在病毒相關持續感染過程中亦具有十分重要的作用。體外實驗表明，重組的sFGL2 可通過抑制Tregs 細胞，使Th1/Th2 淋巴細胞失衡［15］。體內研究中，Foerster 等［16］證實在慢性丙型肝炎外周血中sFGL2 水平與疾病的分期和預后密切相關，肝臟炎性反應和纖維化程度越嚴重，外周血sFGL2 水平越高。而本研究結果提示sFGL2 與病毒性肝炎密切相關。有研究指出sFGL2 是活化型肝臟星狀細胞的效應分子，參與調控HBV 相關肝癌患者的T 淋巴細胞功能，而T 淋巴細胞失衡及免疫耐受是導致HBV 感染后慢性化成為CHB的關鍵性因素之一［17］。綜上推測，sFGL2 可能抑制了機體針對于HBV 的T 淋巴細胞活性，導致機體產生免疫耐受，從而促進HBV 的復制和肝病的進一步發展。因此，sFGL2 在CHB 中的發生發展以及臨床分期中的作用值得深入探討。

陳云茹等［18］研究血漿sFGL2 在HBV-DNA 不同病毒載量間無相關性，sFGL2 水平與CHB 患者肝功能密切相關。這些結果表明，sFGL2 參與了肝細胞炎癥壞死過程，從而影響肝臟合成功能。因此，sFGL2 水平有可能成為評估CHB 患者疾病嚴重程度的預測因子，它可作為CHB 診治、病情變化、臨床轉歸的觀察指標，宜在臨床工作中開展檢測。

表3 抗病毒治療前后血漿sFGL2 和sFGL2 mRNA 表達量比較（±s）Table 3 Coparing the levels of plasma sFGL2 and sFGL2 mRNA befor and after antiviral treatment in 25 CHB cases（±s）

表3 抗病毒治療前后血漿sFGL2 和sFGL2 mRNA 表達量比較（±s）Table 3 Coparing the levels of plasma sFGL2 and sFGL2 mRNA befor and after antiviral treatment in 25 CHB cases（±s）

觀察指標血漿sFGL2 濃度sFGL2 mRNA 相對表達量n 25 25抗病毒治療前127.41±24.07 97.26±12.38抗病毒治療后74.40±22.97 25.72±12.52 t 值48.463 22.068 P 值＜0.001＜0.001

本研究中CHB 患者經抗病毒治療3月后，sFGL2 也顯著下降，這與吳盛迪等［19］研究結果一致，提示sFGL2 表達水平與抗病毒治療療效密切相關。因此，sFGL2 可成為CHB 患者抗病毒治療監測指標。然而本研究僅局限于sFGL2 在CHB患者外周血中的表達差異以及分析CHB 患者抗病毒前后該指標的變化，未涉及其機制研究，下一步需進行HBV 對sFGL2 基因的激活功能以及sFGL2抑制Tregs 細胞的相關機制研究。

綜上所述，sFGL2 作為一種免疫調節分子，在CHB 的病理生理過程中具有重要的免疫調控作用。它在CHB 患者外周血中高度表達，與肝損害臨床指標密切相關，可作為CHB 診治、病情變化、臨床轉歸的觀察指標。同時，sFGL2 在CHB 患者抗病毒治療后顯著性下降，它也可作為CHB 患者抗病毒治療療效的監測指標，宜在臨床工作中推廣應用。