醬油中產氣代表性微生物的篩選和檢測方法的建立

張潔

摘 要：本文分析醬油產氣的誘發原因，篩選出醬油樣本中的產氣微生物，通過模擬脹袋環境，找出可疑菌株并進行產氣驗證。采用RCM進行目標菌培養，在pH=7.5、37 ℃厭氧條件下培養18 h，最終檢出引發醬油產氣的代表性微生物丁酸梭菌，且該檢測方法靈敏度較高、準確性強。

關鍵詞：醬油產氣;代表性微生物;微生物篩選

Abstract：This paper analyzes the causes of soy sauce gas production， comprehensively screens microorganisms in soy sauce samples， and finds out suspicious strains and conducts gas production verification by simulating the swelling environment. The target bacteria were cultured by RCM， and cultured under anaerobic conditions at pH=7.5 and 37 ℃ for 18 h. Finally， the representative microorganism Clostridium butyricum which caused soy sauce gas production was determined， and the detection method was proved to be highly sensitive and accurate.

Key words：Soy sauce gas production; Representative microorganisms; Microorganism screening

中圖分類號：TS264.2

醬油釀造是我國食品工業的重要構成部分，產品存放過程中脹袋（瓶）、滲漏問題普遍存在，導致產品品質降低并引發食品安全風險，可能對生產企業經濟效益獲取及市場口碑造成不利影響。為有效避免上述問題，需要通過實驗分析，找出醬油脹袋（瓶）的誘發機理，為醬油產品質量控制方案制定提供理論依據。

1 醬油產氣機理分析

研究表明，醬油產氣機理非常復雜，醬油脹袋（瓶）的原因可大致分為3種：①物理原因，如熱脹冷縮。②化學原因，如酸堿反應。③生物原因，如微生物產氣。以上3種原因中，生物原因被大多數學者所認可，主要是由于醬油產品采用微生物發酵的方式生產，其所處環境中微生物組成非常復雜，目前行業采用巴氏法進行滅菌，很難將醬油內微生物完全滅除。醬油成品中微生物的來源：①灌裝滅菌前空氣、設備系統內存在的耐熱菌。②原材料中的微生物，如乳酸菌、酵母菌等[1]。

2 醬油產氣代表性微生物篩選與檢測

2.1 產氣微生物鑒定

2.1.1 樣本采集

實驗用醬油樣本來自某廠同一生產線同批次生產的高鹽稀態三級醬油產品，包括正常醬油和產氣醬油。

2.1.2 微生物分離

微生物分離在無菌條件下進行，將產氣樣本充分搖勻后，取25 mL樣本加入到225 mL無菌生理鹽水當中，得到10倍稀釋液。分別取100和10-1兩稀釋度樣本0.1 mL均勻涂抹在對應培養基上，其中，細菌分離采用營養瓊脂，培養條件為36 ℃、48 h;霉菌、酵母菌分離采用孟加拉紅培養基，培養條件為28 ℃、5 d;厭氧菌分離采用MRS培養基，培養條件為36 ℃、72 h。

各稀釋度均設置2組平行實驗和1組空白對照，形態不同菌株在培養基內反復純化2～3次，純化菌種經標記后放置于甘油管內，在-80 ℃條件下冷凍保存。

最終，產氣醬油樣本內未分離出酵母菌和霉菌，營養瓊脂和MRS培養基中分別分離出部分細菌和厭氧菌。樣本稀釋梯度為100時，實驗分離出的細菌菌落數量較多、分布密集且黏連現象嚴重，因形態辨別困難，無法進行產氣菌分離。樣本稀釋梯度為10-1時，分離出細菌相對分散、數量適中、便于觀察，可用于產氣菌分離。使用革蘭氏染色顯微鏡觀察菌體形態，合并相似菌株，完成菌株初步篩選，最終對營養瓊脂培養基中的8株菌株（編號N1～8）和MRS培養基中分離出的1株菌株（編號M1）繼續做純化處理。

2.1.3 微生物驗證

在相應培養基上刮取已編號純化微生物新鮮菌苔，放入無菌生理鹽水中，制成103 CFU·mL-1的菌懸液。取0.1 mL菌懸液添加至產氣驗證培養基當中分別培養，觀察導管內氣泡生成情況，判斷是否為產氣微生物。如表1產氣驗證結果。

驗證發現，N1～8菌株在14 d內均未產氣，M1菌株的3支試管在7 d后產生一定氣量，14 d后產氣量明顯增加。而陽性對照組和厭氧培養下陽性對照組的3支試管均發生產氣現象，14 d的產氣量要高于7 d，且厭氧培養下陽性對照組的產氣現象更為明顯[2]。由此可以確定M1菌株為導致醬油產氣的微生物。

2.1.4 產氣微生物的鑒定方法

常規法。①細菌。觀察細菌菌落形態、大小、芽孢染色等情況，進行生理特性及生化反應試驗。②酵母菌。觀察菌落特征，進行染色試驗和生理生化試驗。③霉菌。觀察菌落形態及特征。

VITEK2 Compact法。向一次性試管內添加3 mL無菌生理鹽水，使用消毒棉簽沾取單一菌落配制菌懸液，濁度達到0.6～0.7后，停止攪拌，放入填充倉進行測試。

飛行時間質譜法。取純化和產氣驗證后的菌落，將新鮮菌落直接涂抹在MALDI靶板上，使其自然干燥。然后在菌層上添加1 ?L70%的甲酸水溶液，自然干燥后再添加1 ?L基質溶液，干燥后進行質譜分析。

顯微鏡觀察中發現，M1菌株呈現短桿形態，單個或成對出現，革蘭氏染色為陽性。按照《伯杰細菌鑒定手冊》中要求，對M1菌株做過氧化氫酶、硝酸鹽還原等試驗，觀察菌體變化情況。試驗結果如表2所示。