亞麻籽油的安全性與功能性評價

曹亮　黃莉　邊蕊　林妍初　趙娟

摘 要：目的：研究評價亞麻籽油的安全性與功能性。方法：采用高、中、低3個劑量組，進行為期30 d的灌胃實驗，分析測定亞麻籽油對大鼠食物利用率、臟體比與各器官病理組織學的影響，同時，考察亞麻籽油對小鼠體重、免疫器官系數(shù)、吞噬指數(shù)、抗體積數(shù)等多項免疫指標的影響。結果：安全性評價結果表明，與對照組比較，亞麻籽油對大鼠的食物利用率及臟體比無顯著影響（P>0.05），對胃、腸、脾、肝臟、腎臟、卵巢及睪丸等未產(chǎn)生病理學改變;功能性評價結果表明，亞麻籽油對小鼠的體重與免疫器官均無顯著的影響，但可顯著提高吞噬指數(shù)、抗體積數(shù)等免疫功能。結論：亞麻籽油具有非常高的安全性和增強免疫力的功能。

關鍵詞：亞麻籽油;安全性;功能性;評價

Abstract：Objective： Research and evaluation of the safety and functionality of linseed oil. Methods： Three dose groups of high， medium， and low were used for a 30-day gavage experiment to analyze and determine the effects of linseed oil on food utilization， organ-to-body ratio and histopathology of various organs in rats. At the same time， the linseed oil was investigated The effect on mouse body weight， immune organ coefficient， phagocytic index， anti-volume number and other immune indicators. Results： The safety evaluation results showed that compared with the control group， linseed oil had no significant effect on the food utilization rate and organ-to-body ratio of rats （P>0.05）， and had no significant effect on the stomach， intestine， spleen， liver， kidney， ovary and testis. Pathological changes occur; functional evaluation results show that linseed oil has no significant effect on the body weight and immune organs of mice， but it can significantly improve immune functions such as phagocytic index and anti-volume number.

Conclusion： linseed oil has very high safety and immunity enhancement functions.

Key words：Linseed oil; Safety; Functionality; Evaluation

中圖分類號：TS201.4

亞麻是一種高油料作物，又稱胡麻，主要用于植物油脂——亞麻籽油的提取[1]。亞麻籽油中含豐富的營養(yǎng)成分，如維生素E、甾醇等，還含有特有的亞麻木酚素與亞麻肽[2-3]。另外，亞麻籽油的脂肪酸中不飽和脂肪酸含量較高，其中α-亞麻酸含量高達40%以上，是目前最理想的單一植物油脂[4-5]。因其特有的營養(yǎng)成分及比例，研究表明在治療心血管疾病、糖尿病等多種疾病方面具有顯著的療效[6-7]，亞麻籽油被譽為植物界的“深海魚油”，市場開發(fā)前景巨大[8-9]。因此，廣大的學者針對亞麻籽油的制備工藝、參數(shù)優(yōu)化、營養(yǎng)成分進行深入的研究[10-11]。

亞麻籽油因其獨特的營養(yǎng)品質(zhì)，針對其提取及加工已取得了一定的成果[12]，其相關產(chǎn)品的開發(fā)應用前景必然廣闊。因此，本文以大鼠為研究對象，進行為期4周的實驗，主要考察亞麻籽油對大鼠體重、進食量、食物利用率、臟體比的影響，并進一步分析高劑量實驗組的大鼠胃、腸、脾、肝臟等組織病理學的變化，分析亞麻籽油對大鼠身體功能的影響，為其全面利用和開發(fā)亞麻籽油提供科學指導和理論依據(jù)，為開發(fā)功能保健食品提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亞麻籽油（亞麻酸含量40%），由山西五臺山沙棘制品有限公司提供，為淺黃色至黃色液體。體重65～79 g清潔級SD大鼠80只，雌雄各半，由上海萊斯克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK（滬）2012-0008。體重18～22 g清潔級ICR雌性小鼠200只，由上海萊斯克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK（滬）2012-0002。飼料，由上海普路騰生物科技有限公司提供，許可證號：滬飼證（2014）04001。

注射用墨汁，刀豆蛋白A（ConA），MTT，DNFB，丙酮，麻油，SRBC，生理鹽水，雞紅細胞，羊紅細胞，甲醇，Giemsa染色，YAC-1細胞，Hanks液（pH 7.2～7.4），RPM11640完全培養(yǎng)液，乳酸鋰，碘硝基氯化四氮唑（INT），吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）、NAD、Tris-HCl緩沖液（pH8.2），1%NP40，臺酚蘭，1mol/L鹽酸，酸性異丙醇等。

1.2 儀器設備

SHANDON EXCELSIOR全自動密封脫水機，電熱鼓風干燥箱，OlympusIX71倒置顯微鏡，8 mm直徑打孔器，微量血凝試驗板，2-16K通用離心機，RT-6100酶標儀，96孔培養(yǎng)板，Co-150 CO2培養(yǎng)箱，UV-1800紫外可見分光光度計，OlympusIX71倒置顯微鏡，電子天平，顯微鏡。

1.3 實驗方法

1.3.1 受試樣品及配制

亞麻籽油的成人日推薦量為3 g，即0.05 g·kg-1BW（成人體重以60 kg計）。功能性評價實驗組按日推薦量的5倍、10倍、30倍配制受試樣品濃度，分別為0.150、0.050、0.025 g·mL-1的高、中、低3個劑量組，以食用大豆油作為對照組。

臨用前，稱取亞麻籽油15 g與食用大豆油混合均勻至100 mL，為高劑量組;取高劑量組樣品40 mL，與食用大豆油混合均勻至120 mL，為中劑量組;取中劑量組樣品40 mL，與食用大豆油混合均勻至80 mL，作為低劑量組;安全性評價實驗組按照亞麻籽油受試物成人日推薦量的25、50和100倍，設3個劑量組為1.25、2.50、5.00 g·kg-1BW，受試樣品采用同功能性評價小組相同的配制方法。

1.3.2 動物分組與給藥

（1）安全性評價實驗組。參照韓飛等[13]的方法，各性別動物按體重隨機分成4組、每組10只。試驗按照亞麻籽油受試物成人日推薦量的25、50和100倍，設3個劑量組為1.25、2.50、5.00 g·kg-1BW，另設食用大豆油為空白對照。試驗期間單籠喂養(yǎng)，自由進食飲水，每天定點灌胃（10∶00），觀察動物形態(tài)，分別進行試驗。

（2）功能性評價實驗組。200只小鼠隨機分成5大組，再分成4小組，每小組10只小鼠，按0.150、0.050、0.025 g·mL-1的高、中、低劑量組每天定點灌胃（10∶00），連續(xù)灌胃30 d后，分別進行試驗。

1.3.3 安全性評價實驗組實驗方法

對選取的安全性實驗組的大鼠連續(xù)灌胃30 d，進行食物利用率、病理組織學檢查。食物利用率公式為：

（1）

1.3.4 功能性評價實驗組實驗方法

（1）小鼠體重的測定。標記每只小鼠，對小鼠定點測定體重，記錄小鼠的初始體重和終期體重。

（2）免疫器官系數(shù)。參照張勇[14]的實驗方法。小鼠適應性喂養(yǎng)3 d，隨機分成對照組、高劑量組、中劑量組和低劑量組，每組10只。按每日10 mL·kg-1 BW連續(xù)灌胃，連續(xù)30 d，末次給藥5 h后，脫頸椎處死小鼠，稱量小鼠體重，取腹腔液后，無菌分離肝臟和脾臟，稱重。

（2）

（3）碳廓清實驗。末次給藥5 h后，注射印度墨水并記時，2、10 min，分別取內(nèi)眥靜脈叢血20 μL，并立即加入2 mL 0.1%NaCO3溶液中，以NaCO3溶液為空白對照，在600 nm處測定OD值，將小鼠處死后，取出肝臟、脾臟后稱重，計算吞噬指數(shù)a。

（3）

（4）

式（3）中：K-碳廓清指數(shù)，表示吞噬速率;OD1-t1時的吸光度值;OD2-t2時的吸光度值;t1-給墨汁后第2次取血的時間;t2-給墨汁后第2次取血的時間;a-吞噬指數(shù)，反映每單位組織質(zhì)量的吞噬活性。

（4）血清溶血素的測定。將小鼠摘除眼球采血，

2 000 r·min-1離心10 min進行血清的分離，用生理鹽水稀釋不同倍數(shù)并置于微量血凝板內(nèi)，每孔100 μL，加入同體積的0.5%（v/v）的SRBC懸液，混勻，37 ℃

溫箱孵育3 h，觀察血球凝集程度[15]。按公式（5）計算抗體積數(shù)。

抗體積數(shù)=（S1+2S2+3S3+…+nSn） （5）

式中1、2、3......n代表對倍稀釋的指數(shù)，S代表凝集程度的級別，抗體積數(shù)越大，表示血清抗體越高。0級紅細胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圓點狀，四周液體清晰。

（5）遲發(fā)型變態(tài)反應（DTH）檢測。末次給藥

5 h后，對小鼠腹部皮膚約3 cm×3 cm進行脫毛處理，用50 μL的DNFB溶液涂抹均勻致敏;5 d后，再以10 μL的上述溶液均勻涂抹小鼠右耳。24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳，用打孔器取下直徑8 mm的耳片稱重，按公式（6）計算左右耳腫脹度差。

左右耳腫脹度差=右耳重量-左耳重量 （6）

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗的平行試驗次數(shù)至少3次。實驗數(shù)據(jù)以SPSS軟件進行單因素方差分析。經(jīng)方差齊性檢驗，方差齊的實驗數(shù)據(jù)采用LSD法進行統(tǒng)計分析，方差不齊的實驗數(shù)據(jù)采用Tamnane法進行統(tǒng)計分析。當概率值≤0.05時，判定為統(tǒng)計學顯著。

2 結果與分析

2.1 亞麻籽油的安全性分析

2.1.1 對大鼠食物利用率的影響

亞麻籽油對大鼠食物利用率的影響見表1。由表1可知，隨著時間的增加，對照組與各劑量組大鼠的食物利用率呈降低趨勢，與雌性大鼠比較，雄性大鼠的食物利用率普遍較高。其中，雄性大鼠的食物總利用率在34%左右，而雌性大鼠的食物總利用率在24%左右，與同性別同時期的對照組比較，大鼠的食物利用率無顯著差異。說明受試樣品亞麻籽油對大鼠的食物利用率無影響。

2.1.2 亞麻籽油對大鼠病理組織學的影響

各劑量組大鼠檢查未發(fā)現(xiàn)明顯病變，且生化指標未見異常，因此僅選對照組及高劑量作組織病理學檢查。大鼠胃、腸、脾、卵巢和睪丸病理檢測結果見表2，大鼠肝臟與腎臟病理檢測結果見表3。由表2、表3可知，正常肝小葉結構存在，肝細胞無明顯腫脹及顆粒變性，個別肝細胞漿內(nèi)出現(xiàn)少許細小的脂肪空泡，呈輕度脂肪變，脂變干細胞呈散在小灶分布，范圍小。干細胞無壞死改變，少數(shù)肝小葉、肝匯管區(qū)見淋巴細胞等炎細胞浸潤，無纖維組織增生，膽管未見異常;胃和十二指腸黏膜完整，無明顯出血、壞死、糜爛、潰瘍及炎細胞浸潤，無明顯腺體增生萎縮改變;腎皮髓質(zhì)結構清楚，腎小管無明顯腫脹及空泡變性，個別腎間質(zhì)中有灶性炎細胞浸潤，個別腎髓質(zhì)部可見小囊腫;脾白髓、紅髓結構清楚，白髓、紅髓無明顯擴張或萎縮現(xiàn)象;睪丸曲細精管正常，可見各級生精細胞及成熟精子;卵巢發(fā)育正常，可見各級卵泡和成熟黃體。綜合可知，以上病理學改變僅個別動物中發(fā)生，各組標本病理變化無明顯差異，因此，亞麻籽油對各臟器未產(chǎn)生病理學改變。

2.2 亞麻籽油的功能性分析

2.2.1 對小鼠體重的影響

亞麻籽油對小鼠體重的影響如圖1所示。由圖1可知，30 d灌胃試驗結束后，低劑量組小鼠的體重最高為33.2 g，與對照組比較，高、中、低各劑量組小鼠的體重均無顯著差異（P>0.05），說明亞麻籽油對小鼠體重無影響。

2.2.2 對小鼠各組臟器與體重比值的影響

正常時各臟器與體重的比值比較恒定。當動物染毒后，受損臟器重量可能發(fā)生改變，從而引起臟體比的變化。各劑量組胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的測定結果如圖2所示。由圖2可知，與對照組比較，高、中、低各劑量組均無顯著差異（P>0.05）。從統(tǒng)計學方法分析說明了亞麻籽油對小鼠的臟器/體重比值無影響，不能促進免疫器官的增長。

小鼠經(jīng)灌胃不同劑量的亞麻籽油30 d，小鼠免疫功能的變化見表4。免疫細胞包括參與免疫應答及免疫應答相關的細胞，如淋巴細胞、單核-巨噬細胞等。其中單核巨噬細胞具有多種免疫調(diào)節(jié)的功能，而吞噬指數(shù)是反映機體非特異性免疫功能的重要指標。由表4可知，高、中、低劑量組的碳廓清功能顯著高于對照組，且存在一定的劑量依賴關系。說明了不同劑量的亞麻籽油能夠增強單核-巨噬細胞功能。抗體的功能是基于免疫球蛋白分子結構，與其他球蛋白分子區(qū)別在于能與抗原發(fā)生特異性結合和識別抗原的作用。由表4可知，各劑量組顯著高于對照組，隨著受試樣品濃度的增加，抗體生成量更多，從而引起溶血數(shù)量增加，說明了亞麻籽油促進小鼠的抗體生成數(shù)增加。遲發(fā)型變態(tài)反應（DTH）是由T細胞介導的細胞免疫應達的一種類型，是一種常見的免疫反應，因此其反應的強度能反映細胞免疫水平，由表4可知，高劑量組的左右耳腫脹度（即抗體水平）顯著高于對照組，說明了亞麻籽油能夠增強細胞免疫活性。

3 結論

經(jīng)30 d灌胃實驗后，與對照組比較，高、中、低各劑量組對大鼠的食物利用率與臟體比均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。同時，亞麻籽油高劑量組對大鼠的胃、腸、脾、卵巢、睪丸、肝臟以及腎臟等均未產(chǎn)生病理學的改變，說明亞麻籽油對小鼠身體無不良影響，安全性較高;經(jīng)功能性實驗發(fā)現(xiàn)，亞麻籽油對小鼠的體重與免疫器官系數(shù)均無顯著影響，但對小鼠的免疫能力如吞噬指數(shù)、抗體積數(shù)與左右耳腫脹度差等指標具有顯著的提高作用，因此，根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》的規(guī)定，亞麻籽油可提高小鼠的免疫功能，為其在食品、保健食品的開發(fā)應用提供理論依據(jù)。

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