特發性膜性腎病相關診斷生物標志物的研究進展

杜秀日 林栩

[專家介紹]林栩，教授、主任醫師，博士研究生導師，臨床腎臟病學專家?，F任右江民族醫學院附屬醫院黨委書記。主要從事腎小球疾病基礎與臨床相關研究，現為廣西醫學會腎臟病學分會副主任委員、廣西血液凈化質控中心副主任。共發表學術論文80余篇（SCI收錄4篇）。主持國家自然科學基金1項、廣西自然科學基金4項。2014年獲廣西科學技術進步獎三等獎1項，2014年和2016年分別獲得廣西衛生適宜技術推廣獎二等獎和三等獎各1項。主編《腎病臨床診治技巧》《現代實用臨床腎病學》《腎臟疾病臨床診治及血液凈化技術》等專著，參與《內科學》（全國普通高等教育臨床醫學專業“5+3”教材）編著。

【摘要】?特發性膜性腎病（idiopathic membranous nephropathy，IMN）是目前導致成人腎病綜合征的主要病因，發病率逐年上升。IMN的發病機制復雜，病程遷徙，反復發作，可發展為終末期腎臟病，早期發現和干預治療是改善患者預后的關鍵措施。近年來國內外學者對IMN相關診斷生物標志物的研究取得了重大進展，這對疾病的早期診斷有重要意義。

【關鍵詞】?特發性膜性腎病;診斷生物標志物;抗原抗體;蛋白質;轉錄物;代謝物;免疫細胞

中圖分類號：R692.9?文獻標志碼：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.09.001

【Abstract】?Idiopathic membranous nephropathy （IMN） is the main cause of adult nephrotic syndrome，and the incidence rate is increasing year by year.The pathogenesis of IMN is complex，and the course of disease repeatedly migrates，and it can develop into end-stage renal disease.Therefore，early detection and intervention are the key measures to improve the prognosis of patients.In recent years，domestic and foreign scholars have made significant progress in the research of IMN-related diagnostic biomarkers，which is of great significance for the early diagnosis of diseases.

【Key words】?IMN;diagnostic biomarkers;antigen antibody;protein;transcripts;metabolite;immune cells

特發性膜性腎?。╥diopathic membranous nephropathy，IMN）是一種自身免疫介導性疾病，該病在我國以13%的發病幅度逐年升高[1]。IMN患者臨床表現以腎病綜合征為主，余為無癥狀性蛋白尿，若未經干預則30%～40%的患者5～10年內可進展為終末期腎臟病（end stage renal disease，ESRD）[2]。因此，及早進行診治，對改善IMN患者預后、降低病死率等都有著巨大的意義。長期以來，診斷IMN很大程度上依賴腎活檢穿刺檢查，但其有出血、感染等潛在并發癥風險，且禁忌于孤立腎、明顯凝血功能障礙等患者，反復腎活檢可能性不大，可見積極尋找敏感和特異的實驗室生物標志物對診斷IMN意義重大?，F就IMN相關的診斷生物標志物研究進展進行綜述。

1?抗原抗體生物標志物

目前認為補體介導免疫反應引起的足細胞損傷是IMN的主要發病機制。循環自身抗體識別腎小球足細胞上的靶抗原后，與其結合形成循環或原位免疫復合物，沉積在上皮細胞下。經過累積的免疫復合物可激活足細胞表面補體，破壞足細胞結構從而產生蛋白尿[3]。因此，對患者進行足細胞靶抗原及其抗體的檢測將為IMN的診斷提供可靠的思路。

1.1?抗M型磷脂酶A2受體（PLA2R）

PLA2R是一種相對分子量為185 kDa的Ⅰ型跨膜糖蛋白，主要表達于人腎小球足細胞。約70%的IMN患者具有針對PLA2R的循環自身抗體[4]，該抗體被認為是IMN的敏感和特異性生物標志物，目前已被廣泛應用于臨床實踐中。研究發現，通過對血清和尿液進行抗PLA2R水平的檢測，不僅有助于膜性腎病（MN）的臨床診斷，而且對疾病進展、預后轉歸、治療均具有重要意義[5～6]。

1.2?抗1 型血小板反應蛋白 7A 域（THSD7A）

THSD7A 是相對分子量約250 kDa的膜結合蛋白，主要分布于腎小球足細胞基底面、足細胞內吞室、足突和裂隙膜[7]，是IMN 發病的第二靶抗原。作為針對該抗原的特異性抗體，抗THSD7A主要存在于PLA2R抗體呈陰性的IMN患者中，可作為該類患者敏感和特異的診斷生物標志物[8]，且抗THSD7A滴度水平與疾病活動和對治療的反應相關[9]，對IMN的進展和治療期的監測具有重要意義，但其檢出率不高。在一項對578 名中國IMN患者的大批隊列研究中[10]，僅8例患者血清檢測到抗THSD7A，進一步驗證了其檢出率較低的臨床特點，具體作用機制還有待進一步深入研究。

1.3?抗 Nel樣分子Ⅰ型（NELL-1）

NELL-1是一種外分泌型糖蛋白，可在人類胚胎腎細胞中表達，充當細胞外基質成分[11]。SETHI等[12]最新研究發現，NELL-1在經腎臟活檢明確的PLA2R陰性MN患者血清和腎小球中過表達，IF共聚焦顯微鏡顯示NELL-1和IgG共定位于腎小球基底膜，同時檢測到NELL-1循環抗體的存在，表明 NELL-1可能是IgG的靶抗原，并由此推測NELL-1和抗NELL-1與MN密切相關。盡管NELL-1超微結構足細胞的定位以及抗NELL-1在足細胞黏附和縫隙隔膜穩定中的潛在作用尚未確定，但NELL-1和抗NELL-1的發現為原發性 MN的診斷和研究指明了新的方向。

1.4?抗中性肽鏈內切酶（NEP）

NEP是一種能夠消化具有生物活性肽的膜結合酶，是第一個發現的足細胞抗原。胎兒足細胞上該抗原能夠結合抗NEP抗體（IgG4或IgG1，由NEP缺陷的妊娠母體產生后通過胎盤進入胎兒體內）形成免疫復合物，進一步激發補體介導的免疫反應引起新生兒MN[13]。通過檢測尿液中的抗NEP和NEP能夠確定存在抗NEP導致的同種免疫產前MN風險的家庭，且抗NEP IgG1比抗NEP IgG4 在該病的發生、發展中發揮著更為重要的作用[14]。

2?蛋白質生物標志物

患者尿液中的異常蛋白質能夠反映腎臟內發生的多種病理過程，可能是腎臟疾病的潛在非侵入性生物標志物。近年來在IMN患者中檢測到的新型尿蛋白候選物為IMN的診斷開拓了新的領域。

2.1?中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（NGAL）

NGAL是一種在中性粒細胞及炎癥狀態的上皮細胞（包括腎小管上皮）表達的小分子蛋白。與健康對照組相比，IMN患者尿NGAL排泄率升高，且與蛋白尿和腎小球濾過率（eGFR）顯著相關，能夠反映腎小管損傷的嚴重性，可作為IMN中腎小管損傷的尿標記物[15]。此外，其在IMN早期階段可能存在預后價值，但當與已建立的標志物如α-1-微球蛋白或β-2-微球蛋白比較或組合時，不能提高預后準確性[16]。

2.2?足細胞糖萼蛋白（PCX）

PCX是一種位于足細胞頂表面，有著維持足細胞的形狀和裂隙膜作用的跨膜蛋白。IMAIZUMI等[17]使用蛋白質印跡和ELISA發現MN患者尿液PCX（u-PCX）水平上升，隨后通過構建基于u-PCX和臨床參數（包括年齡、eGFR和糖尿病病史等）的組合模型，證明u-PCX可作為MN的診斷標志物和該診斷模型在抗PLA2R敏感性較低的群體（如日本）中的臨床實用性。通過驗證，該診斷模型靈敏度為80.5%，特異性為截止值的73.5%。

2.3?α-1-抗胰蛋白酶（A1AT）

A1AT是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，在先前的研究中被認為是足細胞應激的標志之一，與局灶性節段性腎小球硬化（FSGS）的發展有關[18]。PANG等[19]使用串聯質譜標簽（TMT）技術結合納米級液相色譜串聯質譜分析（LC-MS/MS）對原發性膜性腎?。≒MN）患者進行尿液蛋白質組學研究發現A1AT表達上調，并通過Western blot驗證了其過表達的有效性。在該研究中，PANG等認為 A1AT主要是參與免疫應答和凝血級聯反應，在PMN的發病機理中發揮作用并可作為PMN候選生物標志物。

3?轉錄物生物標志物

轉錄組是由信使RNA（mRNA）、轉運RNA（tRNA）、核糖體RNA（rRNA）和其他的調節非編碼RNAs組成的一系列RNA分子。在腎臟疾病的研究中，通過定量實時聚合酶鏈反應和基因測序等技術對轉錄物的分析可為疾病的遺傳學研究提供重要信息，對疾病的診斷有著不可或缺的意義。

3.1?主要組織相容性復合體-I類分子-C（HLA-C）和鐵蛋白重鏈（FTH1）

HLA-C是人類白細胞抗原的一個基因座，主要參與外源抗原向免疫系統的表達。FTH1則是一種重亞基鐵蛋白編碼基因，能保護近端腎小管上皮細胞和腎臟免受活性氧生成過程中游離鐵活性的影響[20]。WAN等[21]對IMN和健康對照組患者的外周血細胞進行了RNA-seq測序，發現HLA-C基因表達上調，FTH1表達下調，同時用qRT-PCR進行了驗證，結果表明HLA-C及FTH1與IMN相關的可能性很高，對IMN有潛在的臨床診斷價值。然而，它們在IMN患者血清中的水平及具體的發病機制需繼續深入探究闡明。

3.2?黏蛋白3A（MUC3A）基因

MUC3A是一種膜相關黏蛋白，有證據顯示其與局部透明細胞腎細胞癌的預后不良有關[22]，但尚未發現在其他腎臟疾病中報道。MA等[23]對IMN患者血清和尿液外泌體進行circRNA基因測序的研究發現MUC3A基因表達上調并認為其可能是一種潛在的IMN診斷生物標志物。IMN發病過程中的主要補體激活途徑是甘露糖結合凝集素通路，而MUC3A基因編碼的大部分氨基酸是絲氨酸/蘇氨酸[4，24]，因此MUC3A基因可能編碼相關的氨基酸，進而通過甘露糖結合凝集素途徑在IMN的發病過程中發揮重要作用。

3.3?miR-193a

miRNA是一種參與轉錄后基因沉默的非編碼RNA，近年來逐漸在腎臟疾病中檢測到并可作為潛在的非侵入性診斷生物標志物。ZHANG等[25]通過RT-PCR檢測發現miR-193a在IMN患者尿液中高表達，且隨IMN嚴重程度的增加而明顯升高，可見其能夠提示IMN活動的進展。此研究中他們還發現IMN患者組織中Wilms腫瘤1型足細胞 （WT1）/尿液中足細胞裂解素（PODXL）表達下調，并推測miR-193a與WT1和PODXL的組合可能是評估IMN發病和預后的理想方法，且這種聯合診斷還能夠區分IMN患者在各個階段的預后。

4?代謝物生物標志物

代謝物是可通過核磁共振（NMR）、氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）、液相色譜-質譜聯用（LC-MS）等代謝組學技術檢測的小分子化合物，與疾病表型的相關性更高[26]。尿代謝物反映了腎臟受損分子水平，對MN患者尿代謝物的檢測有助于了解潛在的生物標志物和致病機制。

4.1?肌肽

肌肽是一種天然的活性氧（ROS）清除劑，具有腎臟保護作用[27]。2018年TAHERKHANI等[28]使用質子核磁共振（1 H-NMR） 和GC-MS技術分析了原發性膜性腎小球腎炎（MGN）患者和健康志愿者的尿液代謝產物，并通過構建MGN相關的代謝網絡，鑒定了包括肌肽在內的13種差異代謝產物，推測它們是MGN的潛在診斷生物標志物。該實驗中，與健康對照組相比，MGN患者的尿肌肽增加，TAHERKHANI等認為是腎臟組織中ROS水平升高所致。肌肽具有抗氧化、抗炎、抗糖化等特性，可參與腎臟中的不同代謝途徑，而慢性腎臟病會發生氧代謝異常[29～30]，不排除肌肽水平的升高是通過一種適應性機制來抵消MGN中炎癥和氧化應激的增加，可見進一步研究其在MN中的作用可能為疾病的診斷和治療提供創新和有效的策略。

4.2?煙酰胺

煙酰胺是一種具有生物活性的維生素B3吡啶衍生物，研究指出其參與合成的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氫-氧化酶復合4（NOX4）可能通過誘導氧化應激和線粒體異常引起早期多囊腎疾病[31]。結合NMR和氣相色譜-串聯質譜（GC-MS/MS）對MGN患者進行尿代謝組學分析后，TAHERKHANI等[32]發現尿液中煙酰胺含量表達降低，認為其可以作為MGN潛在生物標志物，但單個生物標志物可能對診斷不具有足夠的敏感性和特異性。此外，研究中還發現氮源（尿囊酸）、嘧啶代謝成分和DNA成分（脫氧尿苷）、燃料和能量儲存（5a-膽甾酮、L-棕櫚酰肉堿、表觀甾醇和棕櫚酸）等尿代謝產物均可能對MGN的診斷有一定的幫助。

5?免疫細胞生物標志物

IMN被認為是一種特異性自身免疫性疾病，因此評估免疫細胞可能是一個很好的疾病診斷工具，但是目前針對IMN免疫細胞的診斷研究較少，多為評估IMN病情進展或研究治療效果。

5.1?ICOS+ 濾泡輔助性T（Tfh）細胞和PD-1+ Tfh細胞

Tfh是一種獨立的CD4+效應細胞亞群，主要功能是輔助B細胞增殖和參與體液免疫。ICOS+和PD-1+是Tfh細胞表達的兩個主要細胞外標志物。SHI等[33]在IMN患者外周血細胞中，觀察到高比例的ICOS+/PD-1+ Tfh細胞以及IL-21+Tfh細胞（Tfh細胞中的IL-21）水平上調，這兩個參數與IMN患者的24小時尿蛋白呈正相關，表明它們可能是判斷IMN發展的潛在生物標志物，但其診斷價值需進一步研究評估。

5.2?CD14+ CD163+ CD206+ M2樣單核細胞

M2單核細胞是一種可以分泌IL-10等抗炎介質以觸發Th2免疫反應的細胞， HOU等[34]發現，IMN早期患者外周血循環中的CD14+ CD163+ CD206+ M2樣單核細胞計數升高，并和細胞內IL-10濃度、蛋白尿及血清PLA2R值呈正相關，可見該細胞具有對IMN嚴重程度的評估作用及在早期IMN病理過程的潛在作用。

6?小結與展望

IMN是腎病綜合征的主要病理類型之一，也是ERSD的主要原因，對患者經濟及醫療保健系統增加了巨大負擔。目前腎活檢是診斷IMN的金標準，由于其侵入性的限制使探索新型的診斷生物標志物成為診斷IMN的一個熱點。除抗PLA2R和抗THSD7A外，上述基于抗原抗體、蛋白組學等IMN相關診斷生物標志物尚未得到充分驗證，仍需要進一步深入研究來證實其作為日常實踐中診斷IMN的臨床應用價值。

參?考?文?獻

[1]XU X，WANG G B，CHEN N，et al.Long-term exposure to air pollution and increased risk of membranous nephropathy in China[J].J Am Soc Nephrol，2016，27（12）：3739-3746.

[2]LAI W L，YEH T H，CHEN P M，et al.Membranous nephropathy：a review on the pathogenesis，diagnosis，and treatment[J].J Formos Med Assoc，2015，114（2）：102-111.

[3]RONCO P，DEBIEC H.Pathophysiological advances in membranous nephropathy：time for a shift in patient's care[J].Lancet，2015，385（9981）：1983-1992.

[4]BECK L H，BONEGIO R G B，LAMBEAU G，et al.M-type phospholipase A2 receptor as target antigen in idiopathic membranous nephropathy[J].N Engl J Med，2009，361（1）：11-21.

[5]DONG D，FAN T T，WANG Y Y，et al.Relationship between renal tissues phospholipase A2 receptor and its serum antibody and clinical condition and prognosis of idiopathic membranous nephropathy：a meta-analysis[J].BMC Nephrol，2019，20（1）：1-11.

[6]MAIFATA S M，HOD R，ZAKARIA F，et al.Role of serum and urine biomarkers（PLA2R and THSD7A） in diagnosis，monitoring and prognostication of primary membranous glomerulonephritis[J].Biomolecules，2020，10（2）：319.

[7]TOMAS N M，HOXHA E，REINICKE A T，et al.Autoantibodies against thrombospondin type 1 domain-containing 7A induce membranous nephropathy[J].J Clin Investig，2016，126（7）：2519-2532.

[8]TIAN C X，LI L，LIU T X，et al.Circulating antibodies against M-type phospholipase A2 receptor and thrombospondin type-1 domain-containing 7A in Chinese patients with membranous nephropathy[J].Int Urol Nephrol，2019，51（8）：1371-1377.

[9]ZAGHRINI C，SEITZ-POLSKI B，JUSTINO J，et al.Novel ELISA for thrombospondin type 1 domain-containing 7A autoantibodies in membranous nephropathy[J].Kidney Int，2019，95（3）：666-679.

[10]WANG J，CUI Z，LU J，et al.Circulating antibodies against thrombospondin type-I domain-containing 7A in Chinese patients with idiopathic membranous nephropathy[J].Clin J Am Soc Nephrol，2017，12（10）：1642-1651.

[11]HASEBE A，TASHIMA H，IDE T，et al.Efficient production and characterization of recombinant human NELL1 protein in human embryonic kidney 293-F cells[J].Mol Biotechnol，2012，51（1）：58-66.

[12]SETHI S，DEBIEC H，MADDEN B，et al.Neural epidermal growth factor-like 1 protein （NELL-1） associated membranous nephropathy[J].Kidney Int，2020，97（1）：163-174.

[13]GLASSOCK R J.The pathogenesis of idiopathic membranous nephropathy：a 50-year odyssey[J].Am J Kidney Dis，2010，56（1）：157-167.

[14]VIVARELLI M，EMMA F，PELLé T，et al.Genetic homogeneity but IgG subclass-dependent clinical variability of alloimmune membranous nephropathy with anti-neutral endopeptidase antibodies[J].Kidney Int，2015，87（3）：602-609.

[15]AN C J，AKANKWASA G，LIU J H，et al.Urine markers of renal tubular injury in idiopathic membranous nephropathy：a cross sectional study[J].Clin Chimica Acta;Int J Clin Chem，2019，492：7-11.

[16]MAAS R J，VAN DEN BRAND J A，WAANDERS F，et al.Kidney injury molecule-1 and neutrophil gelatinase-associated lipocalin as prognostic markers in idiopathic membranous nephropathy[J].Ann Clin Biochem，2016，53（Pt 1）：51-57.

[17]IMAIZUMI T，NAKATOCHI M，AKIYAMA S，et al.Urinary podocalyxin as a biomarker to diagnose membranous nephropathy[J].PLoS One，2016，11（9）：e0163507.

[18]SMITH A，LIMPERIO V，De SIO G，et al.A-1-Antitrypsin detected by MALDI imaging in the study of glomerulonephritis：Its relevance in chronic kidney disease progression[J].Proteomics，2016，16（11/12）：1759-1766.

[19]PANG L，LI Q Q，LI Y，et al.Urine proteomics of primary membranous nephropathy using nanoscale liquid chromatography tandem mass spectrometry analysis[J].Clin Proteom，2018，15（1）：1-15.

[20]RECALCATI S，INVERNIZZI P，AROSIO P，et al.New functions for an iron storage protein：The role of ferritin in immunity and autoimmunity[J].J Autoimmun，2008，30（1/2）：84-89.

[21]WAN N，LI D C，ZHOU Z，et al.Comprehensive RNA-sequencing analysis in peripheral blood cells reveals differential expression signatures with biomarker potential for idiopathic membranous nephropathy[J].DNA Cell Biol，2019，38（11）：1223-1232.

[22]NIU T，LIU Y D，ZHANG Y，et al.Increased expression of MUC3A is associated with poor prognosis in localized clear-cell renal cell carcinoma[J].Oncotarget，2016，7（31）：50017-50026.

[23]MA H L，XU Y，ZHANG R R，et al.Differential expression study of circular RNAs in exosomes from serum and urine in patients with idiopathic membranous nephropathy[J].Arch Med Sci，2019，15（3）：738-753.

[24]SEGAWA Y，HISANO S，MATSUSHITA M，et al.IgG subclasses and complement pathway in segmental and global membranous nephropathy[J].Pediatr Nephrol，2010，25（6）：1091-1099.

[25]ZHANG W，REN Y P，LI J.Application of miR-193a/WT1/PODXL axis to estimate risk and prognosis of idiopathic membranous nephropathy[J].Ren Fail，2019，41（1）：704-717.

[26]AHMED K，CHINNAIYAN P.Applying metabolomics to understand the aggressive phenotype and identify novel therapeutic targets in glioblastoma[J].Metabolites，2014，4（3）：740-750.

[27]OMMATI M M，FARSHAD O，GHANBARINEJAD V，et al.The nephroprotective role of carnosine against ifosfamide-induced renal injury and electrolytes imbalance is mediated via the regulation of mitochondrial function and alleviation of oxidative stress[J].Drug Res，2020，70（1）：49-56.

[28]TAHERKHANI A，KALANTARI S，AREFI OSKOUIE A，et al.Network analysis of membranous glomerulonephritis based on metabolomics data[J].Mol Med Rep，2018，18（5）：4197-4212.

[29]FATIH AYDN A，KKGERGIN C，BING L，et al.Effect of carnosine on renal function，oxidation and glycation products in the kidneys of high-fat diet/streptozotocin-induced diabetic rats[J].Exp Clin Endocrinol Diabetes，2017，125（5）：282-289.

[30]ARINSOY T，DEGER S M，ATES K，et al.Prevalence of chronic kidney disease in Turkish adults with obesity and metabolic syndrome：a post hoc analysis from chronic renal disease in Turkey study[J].J Ren Nutr，2016，26（6）：373-379.

[31]KAHVECI A S，BARNATAN T T，KAHVECI A，et al.Oxidative stress and mitochondrial abnormalities contribute to decreased endothelial nitric oxide synthase expression and renal disease progression in early experimental polycystic kidney disease[J].Int J Mol Sci，2020，21（6）：1994.

[32]TAHERKHANI A，NAFAR M，AREFI-OSKOUIE A，et al.Metabolomic analysis of membranous glomerulonephritis：identification of a diagnostic panel and pathogenic pathways[J].Arch Med Res，2019，50（4）：159-169.

[33]SHI X，QU Z H，ZHANG L，et al.Increased ratio of ICOS（+） /PD-1（+） follicular helper T cells positively correlates with the development of human idiopathic membranous nephropathy[J].Clin Exp Pharmacol Physiol，2016，43（4）：410-416.

[34]HOU J，ZHANG M L，DING Y H，et al.Circulating CD14+CD163+CD206+ M2 monocytes are increased in patients with early stage of idiopathic membranous nephropathy[J].Mediat Inflamm，2018，2018：5270657.

（收稿日期：2020-04-14?修回日期：2020-05-17）

（編輯：梁明佩）