健康人群血清25-羥基維生素D水平分析

張素潔， 居 漪， 李 卿， 孫賀偉， 馮雪晴， 金中淦， 李水軍， 李玉杰， 李金蓉

（1.上海市臨床檢驗中心，上海 200126；2.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院徐匯醫(yī)院，上海 200031；3.成都新基因格醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司，四川 成都 611130；4.上海楓林醫(yī)藥醫(yī)學(xué)檢驗有限公司，上海 200231）

維生素D為脂溶性的固醇類衍生物，與鈣和磷的吸收和貯存有關(guān)，有預(yù)防和治療佝僂病的作用[1]。維生素D缺乏是一個全球性的公共衛(wèi)生問題，且維生素D缺乏可能與糖尿病、心血管疾病和腫瘤等均密切相關(guān)[2-4]。維生素D在體內(nèi)主要以維生素D2和維生素D32種形式存在，前者主要來源于植物性食物和補充劑，后者則主要來源于動物性膳食及經(jīng)紫外線照射后自身合成。維生素D2和維生素D3經(jīng)血液循環(huán)后進入肝臟分別轉(zhuǎn)化為25-羥基維生素D2[25-hydroxyvitamin D2，25（OH）D2]和25-羥基維生素D3[25-hydroxyvitamin D3，25（OH）D3]，總稱為25-羥基維生素D[25-hydroxyvitamin D，25（OH）D]，然后在腎臟轉(zhuǎn)化成1，25-羥基維生素D發(fā)揮生理活性[5]。25（OH）D在人體內(nèi)較穩(wěn)定，半衰期為3周，且濃度較高，能反映食物攝入和自身合成的維生素D總量以及人體對維生素D的轉(zhuǎn)化能力。因此，25（OH）D被認(rèn)為是衡量維生素D營養(yǎng)狀態(tài)的最佳指標(biāo)[6]。美國醫(yī)學(xué)研究會推薦健康人群血清25（OH）D＞20 ng/mL有利于骨骼健康[7]。然而，維生素D水平與年齡、人種、膚色、生活習(xí)慣等息息相關(guān)，目前我國還沒有統(tǒng)一的25（OH）D參考區(qū)間。為此，本研究擬對國內(nèi)不同地區(qū)、不同人群中維生素D的分布進行分析，為今后建立統(tǒng)一的參考區(qū)間提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年4—8月上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院中心實驗室、上海楓林醫(yī)藥醫(yī)學(xué)檢驗有限公司和成都新基因格醫(yī)學(xué)檢驗所檢測維生素D的表面健康者974名，其中男454名、女520名，年齡1～100歲。這3家實驗室均參加2018年度上海市臨床檢驗中心組織開展的質(zhì)譜法25（OH）D2和25（OH）D3室間質(zhì)評和正確度驗證計劃，且2次評價結(jié)果均與靶值較為接近。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

所有入選者均為未服用維生素D補充劑，無急性感染、慢性感染、消化系統(tǒng)疾病、腎臟疾病、代謝性疾病、營養(yǎng)性疾病、風(fēng)濕病、內(nèi)分泌疾病或循環(huán)系統(tǒng)疾病，在過去6個月內(nèi)未接受手術(shù)或接受藥物治療、未獻血或輸血。

1.3 方法

3家實驗室均采用同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（isotope dilute liquid chromatography tandem mass spectrometry，ID LC-MS/MS）檢測25（OH）D2和25（OH）D3。具體步驟：在血清樣本中加入一定量的穩(wěn)定同位素標(biāo)記的25（OH）D2/25（OH）D3內(nèi)標(biāo)，混合均勻后通過一系列預(yù)處理方法，將25（OH）D2和25（OH）D3從血清中萃取出來。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用ID LC-MS/MS檢測血清25（OH）D2、25（OH）D3和內(nèi)標(biāo)特異的離子質(zhì)量。根據(jù)25（OH）D2和25（OH）D3及對應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積的比值，計算出血清25（OH）D2和25（OH）D3濃度[8]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用MedCalc 15.8軟件進行統(tǒng)計分析。采用Dixon法確定離群值[9]。采用Kolmogorov-Smirnov法進行正態(tài)性檢驗。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。采用百分位數(shù)法確定第2.5百分位數(shù)和第97.5百分位數(shù)的分布[10]。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 離群值檢驗

根據(jù)Dixon法檢驗結(jié)果，有23個離群值數(shù)據(jù)，最終有效統(tǒng)計數(shù)據(jù)為951個。

2.2 25（OH）D2和25（OH）D3數(shù)據(jù)分布

正態(tài)性檢驗結(jié)果顯示，951名表面健康者血清25（OH）D2和25（OH）D3檢測結(jié)果均呈非正態(tài)分布（P＜0.001）。按性別分組，男、女性血清25（OH）D2和25（OH）D3檢測結(jié)果也均呈非正態(tài)分布（P＜0.01）。

女性血清25（OH）D3和25（OH）D水平均高于男性（P＜0.05、P＜0.01），血清25（OH）D2水平男、女性之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同性別表面健康者血清25（OH）D2、25（OH）D3和25（OH）D水平的比較ng/mL，M（P25～P75）

2.3 不同年齡男、女性表面健康者25（OH）D水平的比較

將男、女性表面健康者按年齡分為1～17歲組、18～29歲組、30～39歲組、40～49歲組、50～59歲組、60～69歲組、70～79歲組、80～89歲組、90～100歲組。1～17歲組男、女性25（OH）D水平均高于其他各年齡組（P＜0.01），18～79歲各年齡組間之間25（OH）D水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），80～89歲組、90～100歲組25（OH）D水平低于其他各年齡組（P＜0.05、P＜0.01）。同年齡組男、女性之間比較，50歲以上各組女性25（OH）D水平高于男性（P＜0.01），其他各年齡組男、女性之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2、圖1。

表2 不同年齡男、女性表面健康者25（OH）D水平分布 M（P25～P75）

圖1 不同年齡男、女性表面健康者血清25（OH）D水平的變化趨勢

2.4 表面健康者血清25（OH）D水平分析

采用百分位數(shù)法統(tǒng)計表面健康者血清25（OH）D水平，女性為3.5～31.5 ng/mL，男性為2.7～29.8 ng/mL。見表3。

表3 表面健康者血清25（OH）D水平統(tǒng)計

3 討論

目前，臨床上有多種方法檢測人血清25（OH）D水平。根據(jù)方法原理不同，分為酶免疫分析法和色譜法。由于所有的維生素D羥化物均可發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，故酶免疫分析法只能檢測25（OH）D的總量，無法區(qū)分25（OH）D2和25（OH）D3。另外，酶免疫分析法對基質(zhì)效應(yīng)敏感，容易與其他非目標(biāo)化合物產(chǎn)生交叉反應(yīng)，特異性較低。色譜法包括高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LCMS/MS）[11]。其中LC-MS/MS是色譜法中最常用的方法，可同時檢測25（OH）D2和25（OH）D3，具有特異性高、分析時間短、樣本用量少等特點，被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”檢測技術(shù)。

維生素D有眾多的骨骼效應(yīng)和非骨骼效應(yīng)。25（OH）D是目前公認(rèn)衡量維生素D營養(yǎng)狀態(tài)的最佳指標(biāo)，因此臨床上對25（OH）D的檢測需求越來越大。目前，國內(nèi)的參考標(biāo)準(zhǔn)大部分采用的是酶免疫分析法，這種方法對基質(zhì)效應(yīng)敏感，易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，造成檢測值偏高[12]。為此，本研究選取了參加上海市臨床檢驗中心開展的質(zhì)譜法25（OH）D2和25（OH）D3室間質(zhì)評和正確度驗證計劃，且結(jié)果與靶值較為接近的3家實驗室，統(tǒng)一采用ID LC-MS/MS進行檢測，保證了檢測方法的準(zhǔn)確性和一致性。

本研究采用多中心、回顧性分析方法，參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP28-A3c文件和我國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T 402—2012，對不同地區(qū)3家實驗室的25（OH）D2和25（OH）D3檢測數(shù)據(jù)進行分析。本研究結(jié)果顯示，951名表面健康者中男女比例為0.9∶1，但60歲及以上的表面健康者偏多，占總?cè)藬?shù)的69%。因此，本研究對60歲及以上的表面健康者也以10歲為區(qū)間進行分組統(tǒng)計。結(jié)果顯示，1～17歲組男、女性的25（OH）D水平均高于其他年齡組（P＜0.01）；80～89歲組、90～100歲組25（OH）D水平低于其他各年齡組（P＜0.05、P＜0.01），25（OH）D水平整體呈隨年齡增長而下降的趨勢。本研究中僅有87例（9%）受試者25（OH）D2≥2.5 ng/mL（最大值為27.5 ng/mL），所以無法單獨對25（OH）D2進行分析，這是否是由各實驗室25（OH）D2檢測限不同或其他原因?qū)е碌倪€需要進一步研究。

綜上所述，基于ID LC-MS/MS的健康人群血清25（OH）D水平的研究對于維生素D參考區(qū)間的建立有重要價值，后續(xù)研究將著重對健康人群25（OH）D2水平進行探討，以便給臨床相關(guān)疾病的診治提供更多參考。