lncRNA SNHG1結(jié)合miR-145促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究

周鋒利， 褚以忞， 李 吉， 楊大明， 彭海霞， 徐 瑩

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院內(nèi)窺鏡室，上海 200336）

胃癌是我國(guó)發(fā)病率較高的惡性腫瘤[1]。目前,胃鏡篩查尚未在我國(guó)全面推廣，多數(shù)胃癌患者就醫(yī)時(shí)已處于進(jìn)展期，5年生存率低，預(yù)后往往不佳[2-3]。因此，深入研究胃癌的發(fā)病機(jī)制對(duì)提升臨床治療效果有重要的價(jià)值及意義。

隨著腫瘤發(fā)病機(jī)制研究的不斷豐富，以往曾被認(rèn)為是無(wú)功能的非編碼RNA在腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用逐漸被關(guān)注。長(zhǎng)度大于200 nt的非編碼RNA為長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）。目前研究表明，腫瘤中有大量lncRNA的表達(dá)異于正常組織[4-5]，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起重要生物學(xué)作用[6]，這使得lncRNA有作為腫瘤生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)的潛力[7-8]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長(zhǎng)19～25 nt非編碼蛋白的調(diào)控小RNA，近年來(lái)有大量研究表明，其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡、侵襲以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等均能產(chǎn)生影響，在腫瘤的診斷中一定的價(jià)值[8-12]。

lncRNA小核仁RNA宿主基因1（small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1）在染色體上位于11q12.3。有研究結(jié)果顯示，SNHG1水平在多種腫瘤中升高[13-16]，并可調(diào)控腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、Y染色體性別決定區(qū)域盒轉(zhuǎn)錄因子9（sex determining region Y-box transcription factor 9，SOX9）、鋅指E-盒結(jié)合同源異形盒1（zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1）等及其所在信號(hào)通路[17]。有研究結(jié)果顯示，SNHG1在胃癌中呈高表達(dá)[14]，其表達(dá)水平與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存期有一定關(guān)系[18]。微小RNA-145（microRNA-145，miR-145）在胃癌組織中呈低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-145有抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移的作用[19-21]。SNHG1可通過(guò)海綿吸附miR-145，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖[22]，但兩者在胃癌中是否有相互作用，并影響胃癌細(xì)胞增殖仍有待進(jìn)一步研究。鑒于SNHG1及miR-145在胃癌組織中的異常表達(dá)及對(duì)患者預(yù)后的影響[14，18]，本研究擬探討SNHG1與miR-145在胃癌發(fā)展中可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

本研究使用的細(xì)胞株及pcDNA3.0空載質(zhì)粒均由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化系侯照遠(yuǎn)教授實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）、RPMI1640、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK8試劑盒購(gòu)自日本Dojindo公司；TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；雙熒光素酶報(bào)告試劑盒及質(zhì)粒載體購(gòu)自美國(guó)Promega公司；β-連環(huán)蛋白（beta-catenin，CTNNB1）兔單克隆抗體、骨髓瘤病毒原癌基因（myelocytomatosis viral oncogene，MYC）蛋白兔單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；β-肌動(dòng)蛋白鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；二抗購(gòu)自美國(guó)Li-COR公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與組織收集

人胃癌細(xì)胞SGC7901、BGC823用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，人腎上皮細(xì)胞HEK 293T、人正常胃黏膜細(xì)胞GES-1細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中均含10% FBS、青霉素50 U/mL、鏈霉素50 μg/mL及L-谷氨酰胺20 mmol/L，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院2016年1月—2017年1月17例胃癌術(shù)后患者的胃癌組織及癌旁組織，17例患者中男12例、女5例；年齡≤60歲4例、＞60歲13例；TNM分期為Ⅰ期+Ⅱ期7例、Ⅲ期+Ⅳ期10例；病理類型為腺癌13例、印戒細(xì)胞癌4例。

1.3 轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)SNHG1、miR-145及敲低SNHG1

將SNHG1互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）序列（Ensembl：ENSG00000255717，MIM：603222）插入到pcDNA3.0空載質(zhì)粒中，并按照文獻(xiàn)[23]報(bào)道的方法進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，在SGC7901、BGC823及GES-1中過(guò)表達(dá)SNHG1。人miR-145雙鏈模擬體、SNHG1抑制劑及陰性對(duì)照（negative control，NC）由上海吉瑪生物技術(shù)有限公司合成，N C雙鏈信息：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3'，5'-AC GUGACACGUUCGGAGAATT -3'。人miR-145雙鏈模擬體：5'-GUCCAGUUUUCCCAGGAAU CCCU-3'，5'-GGAUUCCUGGGAAAACUGGAC UU-3'。SNHG1-homo-128（si-SNHG1-1）：5'-GCCAGCGUUACAGUAAUGUTT-3'，5'-ACA UUACUGUAACGCUGGCTT-3'；SNHG1-homo-582（si-SNHG1-2）：5'-GGUUUGCUGUGUAU CACAUTT-3'，5'-AUGUGAUACACAGCA AACCTT-3'。按說(shuō)明書方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)miR-145及敲低SNHG1。

TRIzol法提取細(xì)胞和組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）定量分析。以小核RNA U6（RNA U6 nuclear small，snRNA U6，U6）為miR-145的內(nèi)參，以β-actin為SNHG1的內(nèi)參。miR-145引物序列為：上游5'-CGACCGTCCAGTTTTCCCAGGA-3'，下游5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'。U6引物序列為：上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。SNHG1引物序列為：上游5'-ACACTGGGAGCC AATGAAACA-3'，下游5'-ACACGAAGTGG AGTTATGGGAAG-3'。β-actin引物序列為：上游5'-GTCACCAACTGGGACGACA-3'，下游5'-CACAGCCTGGATAGCAACG-3'。轉(zhuǎn)染、TRIzol法提取細(xì)胞RNA、逆轉(zhuǎn)錄后行qRT-PCR。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4 CCK8及免疫印跡法實(shí)驗(yàn)

CCK8實(shí)驗(yàn)中，將目的細(xì)胞以1 000個(gè)/孔接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔；在培養(yǎng)的第2、24、48、72、96 h加入CCK8試劑10 μL/孔，孵育1 h后酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。免疫印跡法實(shí)驗(yàn)中，裂解細(xì)胞后，進(jìn)行蛋白定量、等量蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，孵育一抗、二抗后，用Odyssey Li-COR 9120熒光掃描儀（美國(guó)Li-COR公司）進(jìn)行熒光顯影并記錄，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

為驗(yàn)證SNHG1有與miR-145的結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建含有SNHG1預(yù)測(cè)與miR-145結(jié)合位點(diǎn)的片段的psiCHECK2TM質(zhì)粒，構(gòu)建方法參考文獻(xiàn)[23]。24孔板培養(yǎng)293T細(xì)胞至密度70%～80%，不同量的miR-145或NC與psiCHECK2TM-SNHG1的報(bào)告基因質(zhì)粒同時(shí)共轉(zhuǎn)染，24 h后按說(shuō)明書操作收集并裂解細(xì)胞，設(shè)置雙報(bào)告基因程序；先在裂解液中加入LARII試劑檢測(cè)螢火蟲熒光素酶的活性；之后再加入Stop & Glo Reagent試劑檢測(cè)海腎熒光素酶活性；計(jì)算螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性的比值，以此反映psiCHECK2TM-SNHG1的報(bào)告基因活性；將實(shí)驗(yàn)組比值除以miR-145 mimics 0 mg組比值，計(jì)算出psiCHECK2TM-SNHG1報(bào)告基因相對(duì)活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 生物信息學(xué)分析

使用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//kmplot.com/analysis/）分析SNHG1表達(dá)與胃癌生存期的關(guān)系。使用starBase v3.0數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//starbase.sysu.edu.cn/index.php）分析胃癌組織與癌旁組織SNHG1的表達(dá)以及胃癌中SNHG1與miR-145、SNHG1與CTNNB1、SNHG1與MYC表達(dá)的相關(guān)性。采用TANRIC數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//ibl.mdanderson.org）分析胃癌與SNHG1表達(dá)的相關(guān)性以及可能與SNHG1存在相互作用的miRNA。通過(guò)RNA22 v2 microRNA target detection（https：//cm.jefferson.edu/rna22/）網(wǎng)站預(yù)測(cè)SNHG1與miR-145可能的結(jié)合位點(diǎn)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2個(gè)組間比較采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中SNHG1的表達(dá)及其與患者總生存期（overall survival，OS）的關(guān)系

在Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//kmplot.com/analysis/）中使用數(shù)據(jù)集GSE14210（146例）、GSE15459（200例）、GSE22377（43例）、GSE29272（268例）、GSE51105（94例）進(jìn)行生存分析。結(jié)果顯示SNHG1高表達(dá)組（127例）中位OS為27.8個(gè)月，明顯短于低表達(dá)組（221例，中位OS為35.9個(gè)月）[風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR）=1.4（1.06～1.83），P=0.015]，見(jiàn)圖1（a）。

通過(guò)starBase v3.0數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//starbase.sysu.edu.cn/index.php）查找發(fā)現(xiàn)，375例胃癌組織SNHG1的相對(duì)表達(dá)量為3.25（2.60～3.80），明顯高于32例正常胃組織[1.91（1.52～2.32），P=1.4×10-14，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）=4.3×10-13]，見(jiàn)圖1（b）。

圖1 SNHG1對(duì)胃癌OS期的影響及在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)情況

對(duì)17例胃癌患者的胃癌組織及癌旁組織進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示胃癌組織中SNHG1的相對(duì)表達(dá)量為25.35（4.51～65.12），明顯高于癌旁組織[18.66（8.70～153.90）]（P＜0.05），見(jiàn)圖1（c）。

2.2 SNHG1在胃癌細(xì)胞增殖中的作用

CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)48 h后，過(guò)表達(dá)SNHG1的胃癌細(xì)胞系SGC7901和BGC823的增殖速率快于轉(zhuǎn)染pcDNA3.0空載質(zhì)粒的胃癌細(xì)胞系SGC7901和BGC823（P＜0.05），見(jiàn)圖2（a）～（d）。

在胃癌細(xì)胞系SGC7901中敲低SNHG1的表達(dá)，采用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖速率。結(jié)果顯示，與NC比較，培養(yǎng)48 h時(shí)轉(zhuǎn)染siSNHG1-2的SGC7901細(xì)胞的增殖受抑制（P＜0.05）；培養(yǎng)72 h后，轉(zhuǎn)染siSNHG1-1和siSNHG1-2的SGC7901細(xì)胞的增殖均受抑制（P＜0.05）。見(jiàn)圖2（e）、（f）。

圖2 SNHG1對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.3 SNHG1與miR-145在胃癌細(xì)胞與組織中的相關(guān)性及特異性結(jié)合分析

利用生物信息學(xué)分析，通過(guò)TANRIC數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//ibl.mdanderson.org） 分析胃癌中與SNHG1表達(dá)的相關(guān)性以及可能與SNHG1存在相互作用的miRNA。結(jié)果顯示，miR-145與SNHG1呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.421，P=1.17×10-4），見(jiàn)表1。進(jìn)一步分析starBase v3.0數(shù)據(jù)庫(kù)中372例胃癌患者組織中miR-145與SNHG1的相關(guān)性，結(jié)果顯示，兩者亦呈負(fù)相關(guān)（r=-0.37，P=3.81×10-13），見(jiàn)圖3（a）。

在GES-1和SGC7901細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)SNHG1并采用qRT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，隨著SNHG1表達(dá)的升高，miR-145表達(dá)降低（P＜0.05），見(jiàn)圖3（b）、（c）。

通過(guò)RNA22 v2 microRNA target detection（https：//cm.jefferson.edu/rna22/）網(wǎng)站預(yù)測(cè)到SNHG1與miR-145存在結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖3（d）。

熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，隨著miR-145轉(zhuǎn)染濃度的上升，SNHG1報(bào)告基因的相對(duì)活性呈濃度依賴性降低，見(jiàn)圖3（e）。

表1 TANRIC數(shù)據(jù)庫(kù)顯示在胃癌中與SNHG1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)的microRNA

2.4 SNHG1與miR-145結(jié)合對(duì)CTNNB1、MYC蛋白表達(dá)的影響

在starBase v3.0數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)分析372例胃癌患者組織發(fā)現(xiàn)，SNHG1 mRNA表達(dá)與CTNNB1（r=0.12，P=0.025）及MYC（r=0.28，P=2.16×10-8）表達(dá)均呈正相關(guān)，見(jiàn)圖4（a）、（b）。

將miR-145和SNHG1單獨(dú)或共轉(zhuǎn)染至GES-1細(xì)胞內(nèi)，隨后采用免疫印跡法檢測(cè)CTNNB1和MYC蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-145后，CTNNB1和MYC蛋白水平均明顯降低；轉(zhuǎn)染SNHG1后，CTNNB1和MYC蛋白水平明顯升高；同時(shí)轉(zhuǎn)染miR145和SNHG1后，miR-145下調(diào)CTNNB1和MYC蛋白的作用被明顯抑制。見(jiàn)圖4（c）～（f）。

圖4 SNHG1與miR-145結(jié)合對(duì)CTNNB1、MYC蛋白表達(dá)的影響

3 討論

近年來(lái)，隨著生活環(huán)境和飲食結(jié)構(gòu)的改變，STAD發(fā)病率雖有所下降，但其死亡率仍居癌癥死亡率的第3位，占總死亡人數(shù)的8.2%[24]。因此，探究胃癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，找到新的治療靶點(diǎn)仍極為迫切。SNHG1是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)lncRNA，目前發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種腫瘤的發(fā)展及預(yù)后有關(guān)鍵作用，即可直接作用于信使RNA（messenger RNA，mRNA），也能通過(guò)海綿吸附miRNA，起到競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）的作用，影響miRNA對(duì)下游靶基因的調(diào)控。例如，在結(jié)腸癌中通過(guò)影響p53通路促進(jìn)細(xì)胞增殖[25]，肝癌細(xì)胞中競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-195，封閉其活性，從而促進(jìn)疾病發(fā)展[26]，在肺腺癌中作用于ZEB1影響靶細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲等[27]。近來(lái)也有報(bào)道顯示，SNHG1在胃癌中存在高表達(dá)，但其具體的分子作用機(jī)制尚未見(jiàn)詳細(xì)闡述。褚以忞等[28]的研究結(jié)果顯示，在胃癌及癌前病變組織中miR-145水平明顯下降。miR-145可通過(guò)影響MYC水平來(lái)影響胃癌進(jìn)展[21]。既往研究也證實(shí)，在卵巢癌、胃癌等多種腫瘤中MYC為miR-145的直接靶標(biāo)[29-31]。同時(shí)，MYC也是T細(xì)胞因子的靶基因之一，受Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活調(diào)控[32-33]。

本研究首先通過(guò)Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，胃癌患者SNHG1表達(dá)與OS呈負(fù)相關(guān)，通過(guò)starBase v3.0數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)SNHG1在胃癌中高表達(dá)，與qRT-PCR的檢測(cè)結(jié)果一致。本研究結(jié)果還顯示，過(guò)表達(dá)SNHG1能促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，而敲低SNHG1則抑制胃癌細(xì)胞增殖。通過(guò)TANRIC、starBase v3.0數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)SNHG1與miR-145表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，使用RNA22 v2 microRNA target detection網(wǎng)站預(yù)測(cè)到SNHG1與miR-145存在結(jié)合位點(diǎn)，并通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)兩者能有效結(jié)合。通過(guò)starBase v3.0數(shù)據(jù)庫(kù)分析胃癌患者組織發(fā)現(xiàn)，SNHG1表達(dá)與CTNNB1及MYC表達(dá)均呈正相關(guān)。分別過(guò)表達(dá)miR-145、SNHG1及同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-145和SNHG1，發(fā)現(xiàn)miR-145可下調(diào)CTNNB1、MYC蛋白表達(dá)，SNHG1可促進(jìn)CTNNB1、MYC蛋白表達(dá)，且SNHG1能抑制miR-145下調(diào)CTNNB1和MYC蛋白。由此可見(jiàn)，SNHG1在胃癌組織中呈高表達(dá)，且能結(jié)合miR-145，miR-145對(duì)SNHG1的影響呈濃度依賴性。原因可能是SNHG1或能通過(guò)海綿吸附miR-145，抑制miR-145對(duì)下游靶基因的作用，從而上調(diào)miR-145下游CTNNB1、MYC蛋白表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。因此，SNHG1與miR-145的結(jié)合位點(diǎn)可能是胃癌的潛在治療靶點(diǎn)。

由于本研究未用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明胃癌細(xì)胞中SNHG1和miR-145通過(guò)ceRNA上調(diào)CTNNB1、MYC蛋白表達(dá)的機(jī)制，因此SNHG1/miR-145/CTNNB1/MYC軸對(duì)胃癌發(fā)生、發(fā)展的影響還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。