自身免疫性肝炎患兒外周血單個核細胞miRNA-181c表達與干擾素γ、趨化因子配體10、Toll樣受體4的相關性分析

崔海霞， 金春梅， 吳政燮， 金愛花， 張美蘭

延邊大學附屬醫院 檢驗科， 吉林 延吉 133000

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)是一種以肝臟炎癥性改變為主要特點的自身免疫性肝臟疾病，患者主要以高丙種球蛋白血癥、自身抗體陽性以及轉氨酶水平升高為特征，可進展為肝硬化，甚至肝衰竭[1-2]。AIH可發病于各個年齡階段，隨著年齡的增加，發病率隨之增加，高發年齡10～30歲，最小發病率年齡為6個月，女性發病率高于男性[3]。目前對于AIH的發病尚未闡明，一般認為是遺傳因素與環境因素共同作用所引起[4-5]。目前關于兒童AIH的研究報道尚少，本研究旨在探究兒童AIH患者外周血單個核細胞(PBMC)miRNA-181c的表達與干擾素γ(IFNγ)、趨化因子配體10(CXCL10)、Toll樣受體4(TLR4)的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2015年3月-2019年5月本院收治的兒童AIH患者作為AIH組。納入標準：(1)AIH診斷標準參考國際自身免疫性肝炎小組(IAIHG)[6]評分系統；(2)年齡<18歲；(3)起病至確診時間≥1個月；(4)未曾接受免疫抑制劑或激素治療；(5)受試兒童家屬自愿簽署知情同意書。排除標準：(1)病毒性肝炎、肝硬化、其他自身免疫性疾病、惡性腫瘤及其他原因所導致的肝損傷；(2)合并HIV感染。另選取同期健康體檢的兒童作為對照組。

1.2 方法

1.2.1 試劑及儀器 Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；淋巴細胞分離液(達科為生物技術股份有限公司)；SYBR Green Realtime PCR試劑盒(上海吉瑪制藥技術有限公司)；SYBR Green Realtime RT試劑盒(上海吉瑪制藥技術有限公司)；PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；全自動生化分析儀(美國Beckman Coulter公司)。

1.2.2 肝功能及免疫球蛋白指標檢測 采用全自動生化分析檢測兩組受試兒童肝功能及免疫球蛋白指標，包括AST、ALT、GGT、TBil、IgA、IgG和IgM。

1.2.3 PBMC miRNA-181c、TLR4 mRNA檢測 采集受試兒童清晨空腹靜脈血，采用Ficoll分層液分離得到PBMC，使用Trizol法提取PBMC中總RNA， 并進行RNA純度及完整性測定。以提取的RNA作為模板，制備cDNA。然后以cDNA為模板進行PCR檢測，循環參數設定為：95 ℃預變性3 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 40 s，共45個循環，做溶解曲線及擴增曲線驗證擴增產物特異性，設定極限值和閾值，讀取閾循環(Ct)值，以U6作為內參基因，采用2-△△Ct法計算miRNA-181c及TLR4 mRNA相對表達量。real-time PCR反應引物序列(表1)設計參照文獻[7]，引物由上海生工生物工程公司合成。

表1 real-time PCR反應引物序列

1.2.4 外周血IFNγ、CXCL10檢測 采集受試兒童清晨空腹靜脈血，離心后分離血清，采用酶聯免疫吸附法測定IFNγ、CXCL10水平。

1.3 倫理學審查 本研究方案經由延邊大學附屬醫院倫理委員會審批(批號：2015倫審第21號)。

2 結果

2.1 一般資料 AIH組共納入27例，其中19例患兒經肝穿刺檢查確診，男11例，女16例，年齡1～16歲，平均(7.21±2.03)歲，起病至確診時間1～20個月，平均(8.84±3.02)個月。對照組30例，其中男10例，女20例，年齡1～15歲，平均(7.42±3.15)歲。兩組性別、年齡比較差異均無統計學意義(P值均>0.05)。

2.2 肝功能指標比較 AIH組患兒肝功能指標AST、ALT、GGT及TBil水平均高于對照組，差異有統計學意義(P值均<0.001)(表2)。

表2 兩組肝功能指標比較

2.3 免疫球蛋白指標比較 AIH組患兒IgA、IgM及IgG水平均明顯高于對照組(P值均<0.05)(表3)。

表3 兩組免疫球蛋白指標比較

2.4 PBMC miRNA-181c相對表達量比較 AIH組患兒PBMC miRNA-181c相對表達量低于對照組，差異有統計學意義(0.784±0.173 vs 1.106±0.224，t=5.819，P<0.05)。

2.5 IFNγ、CXCL10及TLR4 mRNA水平比較 AIH組患兒IFNγ、CXCL10及TLR4 mRNA表達水平均高于對照組，差異有統計學意義(P值均<0.05)(表4)。

2.6 相關性分析 相關性分析結果顯示，AIH患兒PBMC miRNA-181c表達與IFNγ、CXCL10、TLR4、AST、ALT、GGT、TBil及IgG呈負相關(r值分別為-0.316、-0.348、-0.322、-0.427、-0.442、-0.408、-0.396、-0.321，P值均<0.05)，與IgA、IgM無明顯相關性(P值均>0.05)(圖1)。

表4 兩組IFNγ、CXCL10及TLR mRNA表達水平比較

2.7 各指標對AIH發生影響的單因素分析 采用logistic單因素回歸分析各指標對AIH發生的影響，結果顯示，AST、ALT、GGT、TBil、IFNγ、CXCL10、TLR4 mRNA及miRNA-181c均進入回歸模型(P值均<0.05)(表5)。

3 討論

目前研究[8]認為，AIH發病與自身抗原、遺傳傾向、誘發因素和免疫調節等因素相關。兒童AIH臨床表現各異，可無特異性臨床癥狀，也有部分患兒出現爆發性肝衰竭。根據臨床表現，目前將兒童AIH分為急性、慢性以及隱匿性3種[9]。急性起病的患兒一般表現為厭食、乏力、腹痛、嘔吐、黃疸、嗜睡等，與病毒性肝炎相關癥狀相似，其中部分患兒病情快速進展甚至發展為肝衰竭或肝硬化；慢性起病的患兒主要以肝性腦病、腹水等肝衰竭或肝硬化相關并發癥為主要臨床表現；隱匿性AIH患兒一般有疲勞、食欲下降、消瘦以及間歇性黃疸等非特異性表現；對于合并其他疾病的AIH患兒則主要以肝外癥狀為主要臨床表現[6,10]。肝臟病理是目前診斷兒童AIH的重要方式之一，可有效反映患兒病情嚴重程度以及患兒臨床預后[11]。與成人AIH肝臟病理變化相類似，兒童AIH的典型特征為界面性肝炎以及門靜脈周圍肝細胞玫瑰樣改變[12]。

兒童AIH的發病機制目前尚未闡明，主要認為是遺傳因素以及環境因素共同作用的結果，但免疫系統無疑在其中扮演了關鍵角色。近年來，miRNA在控制和調節免疫方面的作用研究報道日益增多。研究[13-14]顯示，miRNA在多種自身免疫性疾病的發生發展中發揮了重要的調控作用，其中miRNA-181c是免疫調節的重要miRNA之一。miRNA-181c作為miRNA-181家族成員之一，位于第19號染色體上，其基因組結構在進化上非常保守。研究[15]顯示，在原始T淋巴細胞和活化CD4+T淋巴細胞中篩選差異表達的miRNA時，發現miRNA-181c可調控CD4+T淋巴細胞活化潛力；進一步研究發現，體外miRNA-181c表達水平在T淋巴細胞活化過程中有所降低，轉染miRNA-181c模擬物可部分抑制T淋巴細胞活化，從而證實miRNA-181c對CD4+T淋巴細胞具有著負調控作用。

表5 各指標對AIH影響的單因素logistic回歸分析

本研究結果顯示，AIH組患兒肝功能指標AST、ALT、GGT、TBil水平及免疫球蛋白IgA、IgM及IgG水平均明顯高于對照組，與患兒目前臨床檢查情況相符。此外，AIH組患兒PBMC miRNA-181c相對表達量明顯低于對照組，與miRNA-181c在自身免疫性肝病中具有一定的調控作用相似[16]，其在兒童AIH中也出現一定的異常表達。T淋巴細胞在AIH的免疫調節機制中發揮重要作用，其中IFNγ作為輔助性T淋巴細胞(Th)1主要的分泌因子之一，通過激活細胞毒性T淋巴細胞以及巨噬細胞發揮細胞免疫介導效應[17]。CXCL10能夠趨化招募活化的T淋巴細胞、巨噬細胞等炎性細胞遷移，從而介導Th1型炎癥反應，介導免疫細胞的活化與遷移，參與多種免疫系統疾病的免疫調控過程[18]。TLR是近年來發現一類主要表達于天然免疫細胞表面的模式識別受體，其能夠識別損傷以及感染信號，是組織損傷、感染以及炎癥的橋梁，但是過度的TLR信號也與自身免疫疾病的發生有關[19]。IFNγ、CXCL10和TLR4可能是促進自身免疫性疾病發生發展的重要細胞因子，因此本研究分析了患兒外周血miRNA-181c與IFNγ、CXCL10及TLR4表達的相關性，從而進一步了解miRNA對兒童AIH的調控機制。研究結果顯示，AIH組患兒IFNγ、CXCL10及TLR4 mRNA表達顯著高于對照組，與相關研究[20]結果相似，AIH的發生與免疫細胞紊亂有關。此外，相關性分析結果顯示，AIH患兒PBMC miRNA-181c表達與IFNγ、CXCL10、TLR4、AST、ALT、GGT、TBil及IgG呈負相關，進一步提示在AIH患兒中miRNA-181c對疾病的調控與免疫細胞因子IFNγ、CXCL10、TLR4的表達密切相關。miRNA-181c可能通過對機體免疫系統的調控而影響AIH的發生；同時，miRNA-181c表達與患兒肝功能變化有關，也進一步證實了miRNA-181c與AIH疾病的進展有關，miRNA-181c異常表達可能是兒童AIH發生發展的分子調控機制之一。

由于本研究納入樣本量較小，難以針對不同臨床表現類型的AIH患兒及其疾病進程與miRNA-181c調控作用的關系進行深入探索，日后需要進一步擴大樣本量，以獲得更為可靠的臨床數據和更有意義的研究結果。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：崔海霞等負責課題設計，資料分析，撰寫論文；金春梅、金愛花等參與收集數據，修改論文；吳政燮、張美蘭等負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。