一株褐藻膠降解菌的篩選與鑒定

劉文博　唐浩遠　王洪浩　唐櫻冉　劉倩文　馬榮榮　肖秀洳　張雪瑩　孫潔

【摘? 要】我國的海帶產(chǎn)量居全球首位，具有完整的海帶產(chǎn)業(yè)鏈。褐藻膠是海帶細胞的主要成分，其降解產(chǎn)物褐藻寡糖等具有良好的生物活性，在醫(yī)療、食品、化工等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。較傳統(tǒng)的物理法和化學(xué)法進行褐藻膠的降解，采用褐藻膠裂解酶的生物法降解褐藻膠具有高效性、可控性的等優(yōu)點，使得挖掘高效的褐藻膠裂解酶成為褐藻膠加工產(chǎn)業(yè)的重點工作。

本文從榮成海帶養(yǎng)殖區(qū)腐爛的海帶中篩選具有褐藻膠裂解酶活性的菌株，以海藻酸鈉為唯一碳源篩選獲得了1株具有海藻酸鈉降解活性的菌株，其最高酶活可達20.22 IU/mL。經(jīng)鑒定確定其為海洋單胞菌屬（Thalassomonas sp.）的一株細菌。

【關(guān)鍵詞】海帶;褐藻膠降解菌;篩選;鑒定

1. 引言

海帶（Saccharina japonica）是褐藻綱海帶科糖藻屬的大型海藻。海帶不僅是我們補充營養(yǎng)的優(yōu)良食品，也因具有多種醫(yī)療作用，如降低血壓^[1]、抗輻射^[2]、抗凝血^[3]、調(diào)節(jié)免疫及抗癌^[4]、促進智力發(fā)育^[5]、美膚美發(fā)^[6]等多種生理功能而成為一種經(jīng)濟價值較高的褐藻。

褐藻膠是海帶細胞中的主要成分。褐藻膠由β-D-甘露糖醛酸及α-L-古洛糖醛酸兩種糖醛酸單體通過1，4-糖苷鍵隨機聚合而成的鏈狀天然高分子雜多糖^[7]。褐藻膠具有獨特的理化性質(zhì)，如凝膠性及成膜性。此外其具有較好的生物活性，如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抑菌、抗凝血、抗氧化作用，因此，褐藻膠在基礎(chǔ)研究、醫(yī)藥開發(fā)、食品工業(yè)等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用價值^[8-11]。

褐藻膠可被不同方式降解后能夠得到一系列聚合度不同的低聚寡糖^[12]。目前常用的褐藻膠降解方法有：物理法、化學(xué)法、生物法。物理法降解程度不易控制，現(xiàn)已較少使用^[13]?；瘜W(xué)法可分為酸降解法和氧化降解法。兩種處理方式均具有反應(yīng)劇烈、易造成污染環(huán)境的缺點，同時獲得的產(chǎn)物的其生物活性易被破壞從而限制該方法的大規(guī)模使用^[14]。生物法又稱酶解法，主要是通過褐藻膠裂解酶對褐藻膠進行生物降解。該法克服了物理法和化學(xué)法的部分缺點，具有產(chǎn)率高、反應(yīng)條件溫和、可控性強、無污染、產(chǎn)品生物活性高等特點而成為研究熱點。

褐藻膠裂解酶來源廣泛，目前主要從海洋藻類、軟體動物、棘皮動物中分離獲得。本論文從腐爛海帶中篩選了一株高活性褐藻膠降解酶菌株，可為生物法降解褐藻膠獲得褐藻寡糖提供高效的生物酶。

2.實驗材料與方法

2.1實驗材料

榮成海帶養(yǎng)殖區(qū)采集腐爛的海帶。

2.2 培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基（g/L）：5g（NH₄）₂SO₄、2g K₂HPO₄、30g NaCl、1g MgSO4、0.01g FeSO₄、5g海藻酸鈉、2%瓊脂（固體培養(yǎng)基）、蒸餾水1000mL、pH7.5、121℃，滅30min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：5g蛋白胨、1g酵母膏、0.01g FeSO₄、海水1000mL、pH7.5、121℃，滅菌30min。

2.3菌株篩選

腐爛海帶2g，加入5mL無菌海水，無菌棒碾碎，漩渦震蕩1min，梯度稀釋，取合適梯度涂布到初篩培養(yǎng)基上，15℃培養(yǎng)2-3天，挑取透明圈較大的菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于15℃150 rpm條件下培養(yǎng)48h，利用DNS法測定酶活。

2.4酶活測定

取1 mL粗酶液和0.75%海藻酸鈉溶液于25 mL比色管中，振蕩搖勻，40℃水浴20min，加1.5mL DNS，沸水浴5 min，冷卻，定容，實驗組做每組三個平行，以0.75%海藻酸鈉和蒸餾水制成的溶液作空白對照，于520 nm下測吸光值。

酶活力單位（IU）定義：1 mL酶液在上述測定條件下，1min內(nèi)水解底物產(chǎn)生1μg產(chǎn)物所需酶量定義為一個酶活力單位（IU/mL）。

酶活力公式：酶活力（IU/mL）=y×1000×n/t

式中：y為用DNS法測得OD值在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的葡萄糖含量（mg）

n為酶液的稀釋倍數(shù)

t為酶反應(yīng)時間（實驗中均為20min）

2.5菌株鑒定

測定16S rDNA保守序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對，獲取菌株信息，利用生物信息學(xué)軟件MEGA構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

3.實驗結(jié)果與分析

3.1 菌株篩選

挑取菌落周圍有透明圈或凹陷的菌株，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基上，進行復(fù)篩，DNS法計算菌株的酶活，實驗得到菌株的酶活結(jié)果如圖1所示。

從腐爛海帶中，一共篩選出21株具有褐藻膠裂解酶活性的菌株，其中篩選獲得最高酶活菌株的酶活力達到20.22 IU/mL，并將其命名為“GL1號菌”（圖1A）。

3.2GL1號菌株生物量與產(chǎn)酶關(guān)系

為了探究GL1號菌株最佳產(chǎn)酶時間，在菌株培養(yǎng)不同時間點進行取樣，同時測定酶活性和生物量（以O(shè)D600表示），實驗結(jié)果如圖2所示。

通過圖2可知該菌株在36h達到生長高峰，隨后細胞開始破碎死亡。在36h測得酶活力達到最大為24.10 IU/mL，隨著菌不斷的死亡，酶活力也隨之減少。

3.3GL1號菌的分子生物學(xué)鑒定

3.3.1 16S rDNA擴增及菌株鑒定

由圖3可知GL1號菌的16S rDNA片段的片段大小約為1200bp，利用NCBI中的核苷酸數(shù)據(jù)庫，對測序結(jié)果進行BLAST分析，該菌株屬于海洋單胞菌屬Thalassomonas sp.

3.3.2菌株系統(tǒng)發(fā)育樹分析

根據(jù)序列比對結(jié)果選取相似度較高的模式菌株，采用MEGA 7.0軟件中的NJ法，構(gòu)建GL1號菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖4所示：

由圖4可知，目的菌株與海藻海洋單細胞菌Thalassomas actiniarum（NR 025717）在同一分支，親緣關(guān)系最近。

結(jié)論

本研究從腐敗海帶中成功篩選到一株高活性的褐藻膠降解酶，并對其進行鑒定為海洋單胞菌屬，為今后開發(fā)利用海帶，提高海帶的利用價值提供基礎(chǔ)。

致謝

本論文是在黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目202010214067、202010214071資助下完成的。

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本論文是在黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目202010214067、202010214071資助下完成的。