基于16S rDNA快速鑒定細菌的PCR測序方法的建立及其進化關系分析

宋路萍 楊振蘋 王 斌 邢體坤 郝一楠 江 魁 王亞萍 黃 帥 張靜靜▲

1.華蘭生物工程股份有限公司研發中心，河南新鄉 453003；2.華蘭基因工程有限公司質量控制部，河南新鄉 453000

微生物污染是制藥企業生產過程控制及藥品質量評估的重要指標，也是影響消費者用藥安全的關鍵因素[1]。美國FDA公布的藥品召回事件中，由微生物污染風險引起的召回事件占到了49%以上[2]。藥品微生物控制是藥品安全性保障的重要措施。因此加強藥品生產過程微生物監管和風險控制是保障藥品質量、降低用藥風險的重要途徑[3]。在藥品生產的微生物質量控制中，實現微生物“屬”及“種”水平的準確鑒定，對控制藥品質量以及保障消費者用藥安全具有重要意義[4-5]。隨著分子生物學技術的快速發展，微生物鑒定技術也得到飛速發展。近年來，各種基因診斷技術在細菌檢測中不斷開發、利用，尤其是基于聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）的基因診斷技術發揮著越來越重要的作用，是細菌鑒定技術發展的主要趨勢。研究表明，在細菌細胞中RNA堿基的變化比整個基因組的變化要慢得多，保守得多，這是因為RNA的功能一直沒有發生變化。因此有細菌“活化石”之稱[6]。現代微生物學中,利用16S rDNA序列來鑒定細菌的種類以及分析它們之間的進化關系正在被成功運用。基因型鑒定技術如16S rRNA序列比對方法可以鑒定多數細菌，已得到廣泛應用[7-8]。但有研究表明，16S rRNA序列比對方法和RiboPrinter微生物鑒定系統，對一些近緣菌種有一定的鑒定局限性[9-10]。

1 材料與方法

1.1 供試品

細胞培養物中分離的未知菌種（編號為JY-01）與已知菌種（編號為JY-02），由華蘭生物工程股份有限公司研發中心提供。

1.2 材料信息

Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購自生工生物，Taq Plus DNA聚合酶、瓊脂糖H、4S Red Plus核酸染色劑（10 000 ×水 溶 液）購 自 BBI，GeneRuLer DNA Ladder Mix 購自 Thermo Scientific。Taq Plus DNA 聚 合 酶、10×PCR Buffer（含 Mg2+）、dNTP（10mM）、滅菌去離子水購自生工生物，引物27F:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT；由生工生物合成。

1.3 儀器設備

潔凈工作臺購自江蘇蘇潔凈化設備廠，PCR反應擴增儀購自BIO-RAD，高速微量離心機購自Eppendorf，電泳儀、電泳槽購自北京六一生物科技有限公司，凝膠成像系統購自ProteinSimple，微量分光光度計購自美國Thermo公司。渦旋混勻器購自美國精騏有限公司，恒溫培養箱購自上海博訊實業有限公司，恒溫振蕩器購自美國Thermo公司，離心機購自德國賽多利斯公司。

1.4 樣品處理

革蘭染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，通過染色初步確定未知菌種為革蘭陰性細菌或者革蘭陽性細菌。陽性細菌需加入100μL Buffer Digestion和 80μL溶菌酶溶液（重懸菌液，37℃水浴 30min）。

1.5 基因組DNA的提取

利用試劑盒的方法進行基因組DNA的提取，采用裂解和相分離技術，結合DNA制備膜選擇性地吸附DNA的方法達到純化基因組DNA的目的。

1.6 DNA質量的電泳檢測

1.6.1 制膠 根據目的片段的大小確定膠體濃度。以1%濃度為例：稱取0.5g瓊脂糖放入燒杯中，并加入50mL 1×TAE緩沖液，用微波爐加熱溶解至溶液澄清透明。在凝膠托盤中插入梳子，倒入凝膠，待凝膠成形后使用。

1.6.2 上樣 瓊脂糖凝膠在使用前拔掉梳子，放入電泳槽中，點樣孔在負電極方，加入適量的1×TAE緩沖液使其液面高出凝膠2～3mm，用移液槍取3μL DNA樣品，加入0.2μL核酸染色液以及0.8μL 10×上樣緩沖液，混勻后加4μL到凝膠點樣孔中。

1.6.3 電泳 連接好導線（相同顏色的導線與插口相連），開啟電泳儀，調節8V/cm（電壓180V；電流300mA）電泳15～20min，停止電泳。

1.6.4 成像 使用ProteinSimple凝膠成像系統在UV模式下對電泳結束的瓊脂糖凝膠進行成像拍照。

1.7 引物設計

16s rDNA的保守區為所有細菌共有，細菌之間無顯著差異[11-12]。設計引物軟件用Primer Premier 5，在保守區設計通用引物。PCR擴增產物長度：位點測序引物在150～300bp左右，離位點80～150bp，外顯子檢測引物離外顯子上下游150bp左右；目的基因測序的PCR產物條帶一般不超過1200bp。

1.8 PCR反應體系及條件

PCR 反應體系為：Taq Buffer（10×with MgCl2）5μL，dNTP（mix）2μL，引 物 F（10μM）2μL，引物 R（10μM）2μL，Taq酶（5U/μL）0.5μL，模板DNA（20～50ng/μL）2μL。PCR反應條件為：95℃10min激活Taq聚合酶；95℃變性15s，60℃退火和延伸1min，共40個循環。

1.9 電泳檢測

PCR產物取5μL 1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳參數：150V，100mA，10～ 20min電泳成像。PCR產物電泳條帶為所需DNA目的條帶，PCR獲得的DNA產物送交生工生物進行核酸序列測定。

1.10 數據分析

屬于國家生物信息中心的核酸數據庫有GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）、核糖體Ⅱ期工程數據庫（http://rdp.cme.msu.edu/html）、效基因 IDNS數據庫（www.smartgene.ch）等，通常選兩個或以上數據庫進行橫向比對[11]。將測序公司回饋的序列進行分析，測序圖譜（.abl）使用說明：峰圖文件（.abl）可用Chromas軟件或SeqMan軟件打開。在SeqMan軟件中打開，去除峰型圖不準的堿基，將上游引物和下游引物的測序結果拼接在一起，保存拼接好的序列。16S rDNA序列在核糖體數據庫（http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp）上比對；利用BLAST軟件從GenBank數據庫中搜索相關菌株的16S rDNA全序列，采用Clustal X軟件進行多序列比對和同源性分析，確定細菌的種屬，并做系統發生樹加以分析。

2 結果

2.1 革蘭染色結果

將平板培養分離得到的微生物進行革蘭染色，顯微鏡觀察初步判斷為革蘭陽性桿菌，見圖1。

圖1 分離未知菌種革蘭染色結果

2.2 DNA電泳檢測

取5μL DNA溶液1%瓊脂糖、1×TAE緩沖溶液電泳（電壓120～180V）檢測，見圖2。單一條帶說明DNA完整無降解，有明顯的條帶說明濃度可以滿足PCR要求；并用分光光度計檢測濃度和純度，取 1μL檢 OD 值，OD 260/280 在 1.7～ 2.0，說明DNA質量較好，小于1.7有蛋白污染，大于2.0有RNA污染。一般有少量的蛋白與RNA污染不影響普通PCR。

2.3 PCR電泳檢測

取 5μL DNA 溶液 1%瓊脂糖、1×TAE緩沖溶液電泳（電壓120～180V）檢測，PCR產物經過凝膠電泳顯示出的條帶圖譜見圖3。目的條帶為1500bp左右，與理論值相符。單一條帶說明無特異性擴增條帶。

圖2 JY-01和JY-02 DNA電泳檢測圖

圖3 JY-01和JY-02 PCR電泳檢測圖

2.4 測序結果分析

該技術主要依賴生物遺傳結構的多樣性，對特定的靶基因通過PCR進行擴增后，將擴增產物片段進行測序。樣本16S rDNA序列在核糖體數據庫（http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp）及GenBank數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）中進行比對，最終得出菌種鑒定結果。圖4為JY-01樣本16S rDNA序列在核糖體數據庫比對結果。

未知菌種的PCR擴增產物經過測序，結果拼接為1500bp的片段。將JY-01與參考序列按照不同的結構基因和功能基因以及全基因組分別進行了核苷酸同源性分析，結果見圖5（JY-01樣本分離的未知菌株系統發生樹分析結果）。

圖4 JY-01樣本16S rDNA序列在核糖體數據庫比對結果

圖5 JY-01樣本分離的未知菌株系統發生樹分析結果

圖6 JY-02樣本16S rDNA序列在核糖體數據庫比對結果

圖7 JY-02樣本分離的已知菌株系統發生樹分析結果

圖8 JY-02樣本與GenBank數據庫中序列同源性比對結果

根據JY-01樣本16S rDNA序列在核糖體數據庫及GenBank數據庫中比對結果，JY-01樣本被鑒定為Bacillus（桿菌屬），疑似為Bacillus halodurans（耐鹽芽孢桿菌）或Bacillus clausii（克勞氏芽孢桿菌）。其分類單元為：Bacteria；Firmicutes；Bacilli；Bacillales；Bacillaceae；Bacillus。

圖6為JY-02樣本16S rDNA序列在核糖體數據庫比對結果。圖7為JY-02樣本分離的已知菌株系統發生樹分析結果。根據JY-02樣本16S rDNA序列在核糖體數據庫及GenBank數據庫中比對結果，見圖8。JY-02樣本被鑒定為Escherichia coli（大腸埃希桿菌）。其分類單元為：Bacteria；Proteobacteria；Gammaproteobacteria；Enterobacterales；Enterobacteriaceae；Escherichia。鑒定結果與已知菌種信息一致，說明該方法可以用于微生物鑒定。

圖8為JY-02樣本16S rDNA序列在GenBank數據庫中比對結果。結果顯示JY-02樣本與GenBank數據庫中CP040067.1序列同源性高達99.7%。JY-02樣本被鑒定為Escherichia coli（大腸埃希桿菌）。由于JY-01僅僅鑒定到屬，根據實驗要求，如需進行鑒定至種，需要進行二代測序。

3 討論

鑒定病原細菌有多種方法，如形態學觀察、血清分型、生化分析、遺傳學分析等。遺傳學分析法有基因序列分析、分子標記檢測、核酸分子雜交等[13]。16S rRNA基因在基因序列分析中應用最多[14]。16S rDNA鑒定是指用利用細菌16S rDNA序列測序的方法對細菌進行種屬鑒定。包括細菌基因組DNA提取、16S rDNA特異引物PCR擴增、擴增產物純化、DNA測序、序列比對等步驟。是一種快速獲得細菌種屬信息的方法。16S rRNA普遍存在于原核生物中。rRNA參與生物蛋白質的合成過程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物進化的漫長歷程中保持不變，可看作為生物演變的時間鐘。在16S rRNA分子中，既含有高度保守的序列區域，又有中度保守和高度變化的序列區域，因而它適用于進化距離不同的各類生物親緣關系的研究。目前，傳統鑒定技術存在敏感度低、耗時長的缺點，如通過表現型鑒定的生化分析過程存在較多不確定因素[14]。比較而言，基因型更穩定受環境因素影響較小[15-16]。因此，本研究建立的16S rRNA基因序列分析法較生化分析法更加穩定。同時建立一種快速可靠、成本低廉、操作簡便的快速鑒定細菌的PCR測序方法的建立是非常有必要的。