三種無縫克隆試劑盒連接效率的比較

邢體坤 王 斌 郭冰峰 宋路萍 楊振蘋 荊新蕊 郝一楠 張靜靜▲

1.華蘭生物工程股份有限公司研發中心，河南新鄉 453003；2.華蘭基因工程有限公司質量控制部，河南新鄉 453000；3.華蘭生物工程股份有限公司血制研發部，河南新鄉 453003

DNA克隆技術在生物醫學領域研究中應用廣泛[1]。傳統酶切連方法耗時長、耗費高、效率低，不能滿足目前分子生物學發展需求[2-3]。為提高克隆技術連接效率，近年來開發出多種新方法[4-6]。其中，無縫克隆是新技術中的典型代表[7]，位點選擇靈活、連接產物無冗余序列、連接效率高且簡單快捷，受到廣大研究者的青睞[8-17]。本研究對比三個廠家試劑盒價格、總克隆數和陽性克隆率，表明生工生物工程（上海）股份有限公司的無縫克隆試劑盒為最佳選擇。

1 材料與方法

1.1 供試品

pUC57-HNB2M11由金斯瑞生物科技有限公司合成，DH5a感受態購自生工生物工程（上海）股份有限公司，pET-26b載體由華蘭生物工程股份有限公司保存。

1.2 材料

蛋白胨購自OXOID，酵母粉購自BD，DH5a感受態、瓊脂粉購自生工生物工程（上海）股份有限公司，Nco I、Xho I購自 Takara，Gene JET Plasmid Miniprep Kit購自 Thermo，EasyPfu DNA Polymerase購自 TransGen Biotech，Ready-to-Use Seamless Cloning Kit購自生工生物工程（上海）股份有限公司，Kit A購自廠家A，KitB購自廠家B。

1.3 儀器設備

搖床（HYG-A）購自太倉實驗設備廠，臺式離心機（1-15PK）購自德國賽多利斯，水浴鍋（HWS-28）購自上海一恒科學儀器有限公司，潔凈工作臺（SW-CJ-2FD）購自蘇州安泰空氣技術有限公司，PCR（S100）反應擴增儀購自BIO-RAD，紫外儀（WD-9403C）、電泳儀（DYY-10C）、電泳槽（DYCP-31DN）購自北京六一生物科技有限公司，凝膠成像系統（AlphaImager HP）購自 ProteinSimple，微量分光光度計（NanoDrop ONE）美國 Thermo Fisher，渦旋混勻器（HYQ-2121A）購自美國精騏有限公司，恒溫培養箱（BPX-272）購自上海博訊實業有限公司。

1.4 片段線性化

本研究目的基因HNB2M11插入原核表達載體pET26b的PelB信號肽開放閱讀框（ORF），采用酶切或PCR擴增連接片段線性化。

1.4.1 載體線性化 原核表達載體pET26b采用Nco I和Xho I雙酶切，膠回收純化獲得線性化載體。

1.4.2 目的基因線性化 無縫連接試劑盒要求目的基因HNB2M11兩端與pET26b載體末端形成15-25 bp同源序列。擴增引物設計要求引入15-25bp的載體末端序列形成重組位點，即5’-15-25bp同源序列-所需酶切位點序列-特異性引物序列-3’。具體序列如下：引物F：ccagccggcgatggccatgg-HNB2M11 5’端 20bp 序 列；引 物 R： tggtggtggtggtgctcgag-HNB2M11-XhoI- 3’端14bp序列（反向）。

1.5 目的片段與載體的重組

將目的DNA片段和線性化載體以一定的摩爾比加到PCR管中進行重組反應。組分加入量2×Seamless cloning Master Mix 10μL，線性化載體50～ 100ng，插入片段 10～ 30ng，ddH2O 補足至20μL，50℃反應15～20min。反應結束立即將離心管置于冰上冷卻2min，待轉化。

1.6 轉化

加5μL的反應體系到DH5α感受態細胞中，輕彈數下，置冰上孵育30min。42℃水浴中熱激90s后快速放入冰上5min。加入500μL LB液體培養基，37℃孵育45～60min。4000rpm離心3min收集菌體去上清，均勻的涂布在含卡那霉素抗性固體培養板過夜37℃培養。

1.7 菌液PCR

挑取單個菌落至裝有20μL去離子水的離心管，100℃熱擊2min。取1μL上清為模板，T7和T7TER作為引物，20μL PCR體系進行擴增反應，凝膠核酸電泳觀察實驗結果。

2 結果

2.1 載體線性化

pET26b表達載體按照50μL體系酶切反應（Xho I 2.5μL，Xho I 2.5μL，10×K Buffer 5μL，DNA ≤ 2μg，滅菌水加至 50μL）Nco I和 Xho I雙酶切 4 管，37℃孵育3h。制備1%瓊脂糖濃度的凝膠，待凝膠成形后上樣。調節8v/cm（電壓：150v，電流：300mA）電泳15～20min（圖1）。膠回收線性化pET26b載體，紫外吸收法檢測濃度核酸濃度為26.1ng/μL。

圖1 pET26b酶切線性化核酸電泳圖注 ：M:MarkerDL10000;1 ～ 4: pET26b Nco I和Xho I雙酶切線性化四個重復上樣孔

2.2 目標片段擴增

金斯瑞合成pUC57-HNB2M11作為模板，引物F和R作為引物，按照50μL PCR反應體系[EasyPfu Buffer(10×) 5μL，dNTPs（2.5mM）2μL，引 物F（10μM）1μL，引 物 R（10μM）1μL，EasyPfu DNA Polymerase（2.5U/μL）1μL，模板 DNA（20～50ng/μL）2μL，加水至50μL]擴增。PCR反應條件為：95℃ 5min激活 Taq聚合酶； 95℃變性 30s，60℃退火 30s，72℃延伸 1min，共 30 個循環。經過電泳檢測結果顯示擴增出條帶單一，片段大小符合預期（圖2）。PCR產物濃度519.1ng/μL。

2.3 重組反應

參考生工生物工程（上海）股份有限公司的Ready-to-Use Seamless Cloning Kit，Kit A 和 Kit B說明書，按照表1體系和反應條件進行重組，重組完成后冰凍2min，待轉化。

2.4 菌液PCR鑒定

生工、廠家A和廠家B三種無縫克隆試劑盒連接體系轉化DH5α后，分別長出107、86和16個克隆。挑22、22和16個克隆菌液PCR鑒定。生工挑取22個單克隆菌液PCR鑒定，其中20個為陽性克隆，見圖3。

圖2 pET26b和HNB2M11線性化產物鑒定核酸電泳圖注：1.pET26b Nco I+Xho I純化后圖譜；2.HNB2M11 PCR 產物圖譜

表1 生工、廠家A和廠家B無縫克隆試劑盒評價實驗重組體系與條件

圖3 生工無縫克隆試劑盒評價實驗菌液PCR鑒定核酸電泳圖注：其中1 ～ 22為生工Seamless cloning Master Mix試劑盒的22個單克隆菌液PCR鑒定的結果，最后一個為陰性

圖4 廠家A無縫克隆試劑盒評價實驗菌液PCR鑒定核酸電泳圖注：其中1 ～ 22為Kit A的22個單克隆菌液PCR的結果，最后一個為陰性

圖5 廠家B無縫克隆試劑盒評價實驗菌液PCR鑒定核酸電泳圖注：其中1 ～ 16為Kit B的16個單克隆菌液PCR鑒定的結果，最后一個為陰性

廠家A挑取22個單克隆菌液PCR鑒定，其中16個為陽性克隆，見圖4。

廠家B挑取16個單克隆菌液PCR鑒定，其中7個為陽性克隆，見圖5。

從轉化總克隆數量，商品價格及陽性克隆百分比三方面考慮，生工的 Seamless cloning Master Mix無縫克隆試劑盒為文庫構建最佳選擇，見表2。

3 討論

無縫克隆是一種新型、快速、簡潔的克隆方法，可同時將1～4個DNA片段克隆到任何載體中，陽性率達到95%以上。實驗時只需插入的DNA片段末端引入載體末端15～25個同源堿基序列，反應時間短至20min，即可在載體的任意位點完成克隆重組。本研究利用該技術完成多種表達質粒和噬菌體篩選文庫構建，證實其技術優點：（1）依賴末端同源片段重組連接，位點選擇靈活，無需考慮酶切位點等限制因素；（2）陽性率高，本研究在His6標簽堿基重復區域重組，陽性率仍在90%以上；（3）大大簡化了DNA克隆的實驗步驟，顯著提高了基因克隆的成功率。影響無縫試劑盒連接效率因素繁多：同源序列GC含量，重復序列，目標片段大小、純度、定量方法、感受態轉化效率等。目前，不同廠家無縫克隆的試劑盒質量參差不齊，選擇合適產品成為一種挑戰。本研究選擇三個廠家的無縫克隆試劑盒對比其單克隆的數量和連接效率，評價方法簡單高效。此外，本次評價在未經純化的PCR產物，含His6標簽同源序列（GC含量大于60%且重復）等不利條件下進行，評價結果相對客觀可信。最后，結合商品性價比綜合考慮，生工無縫克隆的試劑盒為文庫構建等陽性率要求嚴格實驗的最佳選擇。

表2 生工、廠家A和廠家B無縫克隆試劑盒評價匯總