下調垂體瘤轉化基因1對膠質瘤細胞SHG44血管生成擬態及細胞周期的影響

崔立山 林 婷 張健莉 馮三平 曹 洋 曹 穎 吳德龍 蘇 砍 劉金鳳

1.廈門市第五醫院神經外科，福建廈門 361101；2.廈門大學醫學院基礎醫學部，福建廈門 361102；3.廈門市第五醫院神經內科，福建廈門 361101；4.廈門市中醫院藥劑科，福建廈門 361101

神經膠質細胞瘤約占原發性腦腫瘤的70%，且惡性腫瘤居多[1-3]。垂體瘤轉化基因1（pituitary tumor-transforming gene，PTTG1）是一種常見致癌基因在多種腫瘤細胞中高表達，如結腸癌SW480，肝癌HepG2、Huh7，乳腺癌MCF-7以及卵巢癌SKOV3等[4-9]，然而其對膠質瘤以及膠質瘤細胞血管生成擬態和細胞周期的影響未見報道。

本研究使用PTTG1 siRNA轉染SHG44細胞沉默PTTG1基因，研究PTTG1表達降低對惡性膠質瘤細胞血管生成擬態和細胞周期的影響，同時探究PTTG1調控細胞周期的可能機制，從而為膠質瘤的臨床治療提供新的思路。

1 材料及方法

1.1 一般材料

SHG44細胞株（廈門大學眼科所饋贈）；胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM高（美國賽默飛世爾公司）；PTTG1 siRNA、陰性對照siRNA及轉染試劑（中國銳博生物科技有限公司）；逆轉錄試劑盒（瑞士羅氏公司）；Trizol（美國賽默飛世爾公司）；SYBR Premix Ex TaqII（寶日醫生物技術有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（美國賽默飛世爾公司）；PVDF膜（美國賽默飛世爾公司）；羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（杭州聯科生物技術股份有限公司）；過硫酸銨（AP）、30%聚丙烯酰胺凝膠、牛血清清蛋白（BSA，中國索萊寶公司）；蛋白抗體（美國賽默飛世爾公司）；ECL化學發光法檢測試劑盒（中國索萊寶公司）；基質膠基底膜基質（美國康寧公司）；PI細胞周期檢測試劑盒（美國西格瑪公司）。

1.2 儀器

T-Gradient梯 度 PCR 儀（德 國 Biometra公司）；7300型熒光實時定量PCR儀（美國ABI公司）；PowerPac Bio-rad電 泳 系 統（美 國 伯 樂 公司）；IS4000R全自動圖像工作站（美國柯達公司）；Multiskan FC多功能酶標儀（美國賽默飛世爾公司）；Beckman Gallios流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）；Olympus IX51倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.3 實時定量PCR

將細胞沉默處理24h后，加入1mL Trizol裂解細胞，并依次加入氯仿、異丙醇、乙醇，進行一系列操作后提取到總RNA。配置成為20μL混合物后進行逆轉錄，此體系中包含了1 μg總RNA。擴增所用到的引物序列可以在表1中查找。按照熒光定量PCR檢測試劑盒的說明進行實驗。GAPDH作為內參，用2-ΔΔCT[ΔΔCt = （Ct目的基因-Ct管家基因）實驗組- （Ct目的基因-Ct管家基因）對照組]計算目的基因 mRNA 的相對濃度。

1.4 蛋白質印跡

得到總蛋白后，使用BCA蛋白定量的方法檢測細胞中蛋白含量。選擇1%聚丙烯酰胺凝膠，隨后利用PVDF膜進行濕轉。BSA室溫封閉1h。一抗在4℃冰箱內進行孵育過夜。隔日洗膜，室溫孵育二抗，ECL試劑盒顯影。使用 Image Station 4000R軟件分析蛋白質條帶灰度值[10]。

表1 qPCR引物序列

1.5 血管生成擬態形成實驗

解凍基質膠，使用冷卻移液管，將基質膠混合均勻。加入150μL基質膠作為細胞的生長表面，將板置于37℃下30min，形成基質膜即可。分別用PTTG1 siRNA或陰性對照siRNA轉染SHG44細胞。siRNA 轉染操作步驟如下：將 1X riboFECTTMCP Buffer和 riboFECTTMCP Reagent輕 輕 吹 打 混 勻，加 入20μM siRNA 儲存液，顛倒混勻，室溫孵育 15min。將轉染液加入無雙抗完全培養基，顛倒混勻。將培養板置于 37℃的CO2培養箱中培養 24h后換液。之后將 Matrigel Matrix 膠和 10% FBS DMEM 培養基1∶1混合均勻后加入24孔細胞培養板。凝固后每孔鋪入105個細胞，24h后細胞附著于膜，利用倒置顯微鏡在明廠條件下觀察細胞并拍照（物鏡 10×）[11]。

1.6 流式細胞儀檢測細胞周期

取對數期生長良好的SHG44細胞，PTTG1 siRNA或陰性對照siRNA以50nmol/L的濃度轉染細胞。24h后胰酶消化細胞，離心后棄上清。PBS洗滌后加入70%的乙醇，4℃冰箱固定過夜。PBS洗滌后分別加入0.5mL染色緩沖液、25μL PI染液和 10μL RNase A。室溫避光孵育 30min。使用美國Beckman Gallio流式細胞儀進行樣品檢測，并用Flowjo V10軟件進行相應的統計分析。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 siRNA對PTTG1 mRNA和蛋白表達的影響

首先將 PTTG1 siRNA（50nmol/L）或陰性對照siRNA（NC siRNA）轉染SHG44細胞，24h后通過 PCR 和 Western blot檢測 PTTG1 mRNA 和蛋白質的表達。Control組與NC siRNA組mRNA和蛋白水平比較均差異無統計學意義（圖1AB）；與NC siRNA組相比，PTTG1 siRNA能夠明顯抑制PTTG1 mRNA（見圖1A）和蛋白表達（圖1B），P＜0.001。

圖1 PTTG1基因mRNA和蛋白的表達注：Control組PTTG1蛋白灰度值設為1，將其他組蛋白灰度比Control組灰度，得到相對灰度值，NC siRNA組為1.046，PTTG1 siRNA 組為 0.4819，與 NC siRNA 組比較， ＊＊＊P ＜ 0.001

2.2 降低PTTG1對SHG44細胞血管生成擬態的形成的影響

為了觀察PTTG1的表達對SHG44細胞的血管生成擬態形成能力的影響，進行了血管擬態生成實驗。結果發現：陰性對照siRNA（NC siRNA）組SHG44細胞成網格狀，細胞緊密交聯（圖2Aa）；而PTTG1 siRNA組細胞接近單個分布，并不形成網格狀（圖2Ab），即血管生成擬態形成能力受到抑制。NC siRNA組平均每視野細胞數量為（90.67±7.10）個，PTTG1 siRNA 組平均為（20.33±2.40）個，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.001），見圖2B。

2.3 抑制PTTG1的表達對SHG44細胞周期的影響

圖2 血管生成擬態形態和統計圖（10×）

通過流式細胞術對細胞中DNA含量進行測定（圖3Aa-b）。結果發現：陰性對照NC siRNA組和PTTG1 siRNA組G1期細胞百分比分別為（45.53±2.221）%、（44.07±2.122）% （圖3Ba）；S期細胞百分比分別為（28.67±2.313）%、（20.67±0.8686）% （圖3Bb）；G2期細胞百分比分別為（20.57±1.033）%、（15.4±0.9609）% （圖3Bc）。經t檢驗，兩組間S期和G2期細胞百分比比較差異有統計學意義（P＜0.05）。即在膠質瘤中，與NC siRNA組相比，PTTG1 siRNA組細胞增殖阻滯于G2/M期，細胞增殖受到明顯抑制。

2.4 PTTG1調控SHG44細胞周期的作用機制

C-myc以及CyclinD1參與細胞增殖調控，還能夠調節Wnt通路，是重要的原癌基因。且AKT信號通路的激活是調節C-myc蛋白表達的主要機制之一。本研究運用實時熒光定量PCR（圖4A）和Western blot（圖4B）進行了相關信號通路的探究，細胞周期相關蛋白的灰度值見表2。實驗結果表明，與陰性對照siRNA組比較，PTTG1 siRNA組細胞中C-myc和CyclinD1 mRNA表達水平明顯降低；p-AKT、C-myc和CyclinD1 蛋白表達水平明顯降低。表明PTTG1可能通過AKT/C-myc/CyclinD1信號通路發揮相應的生物學作用。

3 討論

圖3 SHG44細胞周期（與NC siRNA組比較，＊P＜0.05）

圖4A

圖4 細胞周期相關蛋白的表達

表2 細胞周期相關蛋白的灰度值

腦膠質瘤是臨床上常見的惡性腫瘤，目前手術切除是主要的治療方式，但對于惡性程度較高的患者手術切除的方式治療效果不佳，所以尋找更好的治療方法成為一種必然趨勢[10-11]。PTTG1作為一種癌基因，其已被發現在細胞轉化、增殖和腫瘤形成中具有重要作用。已有臨床數據顯示，PTTG1與惡性腫瘤患者的預后及中位生存率密切相關[12-17]。本課題組之前的研究發現，PTTG1在膠質瘤細胞SHG44中的表達水平可影響腫瘤遷移、侵襲等多種生物學特性，在此次研究中，本研究將進一步探究PTTG1作為腫瘤的一種重要調控基因，其對腫瘤血管生成擬態形成及細胞周期的影響[17-19]。

“血管生成擬態”成為新的衡量指標，在正常組織和腫瘤組織的區分中被提及。在這項研究中，本研究用Matrigel Matrix膠進行細胞血管生成擬態形成能力的檢測，結果表明PTTG1 siRNA轉染細胞24h后，神經膠質瘤細胞SHG44呈現單個分布，即細胞彼此之間不形成相互連接成網狀的網絡通道，表明PTTG1低表達抑制了SHG44細胞的血管生成擬態生成[20-22]。

腦膠質瘤難以攻克的原因之一是腫瘤細胞的惡性增殖能力，為了探究PTTG1對惡性膠質瘤細胞增殖周期的影響，本研究采用流式細胞術檢測了SHG44細胞周期情況。結果顯示，PTTG1 siRNA組細胞周期較NC siRNA組比較，細胞周期發生明顯阻滯，即細胞增殖受到抑制。本研究運用PCR和Western blot進行了相關信號通路的探究。調節C-myc含量的機制之一是激活AKT。CyclinD1以及C-myc的共同點是參與到增殖過程中，還是調節Wnt通路的關鍵原癌基因。C-myc作為一種癌基因，影響了腫瘤周期等多種生物學特性，其對腫瘤發展進程的推動不可忽視。研究發現，PTTG1 siRNA組細胞中C-myc和CyclinD1 mRNA表達水平明顯降低，p-AKT、C-myc和CyclinD1 蛋白表達水平明顯降低，表明PTTG1可能通過AKT/C-myc/CyclinD1信號通路發揮相應的生物學作用。以上結果均提示PTTG1可能作為有效靶點參與了膠質瘤細胞血管生成擬態形成和細胞周期調節[22-23]。

綜上所述，抑制PTTG1的表達可以抑制膠質瘤細胞的增殖分化，并降低其惡性程度，是膠質瘤臨床治療研究中的新思路。