18份團桑種質資源的ISSR分析＊

劉 玲，程 明，，唐仕成，鄭 丹，柯皓天，李瓊秀

（1.四川省絲綢工程技術研究中心，四川 成都 610031； 2.四川省絲綢科學研究院，四川 成都 610031）

四川幅員遼闊，自然環境復雜多樣，擁有豐富的桑樹資源，一些科研單位利用分子標記輔助育種、輻射育種、化學誘變等方法選育了大量桑樹品種［1］，為蠶桑生產作出了很大貢獻。四川省絲綢科學研究院長期致力于桑樹育種及其分子生物學研究，目前已育成了人工四倍體桑品種團桑6號［2］和團桑 11號［3］、果桑品種團桑 9 號［4］，它們分別于2013年、2013年和2016年通過了四川省農作物品種審定委員會審定。目前在四川省絲綢科學研究院的桑樹資源圃中保存著百余份種質資源，其中團桑2號、團桑3號、團桑4號、團桑B號、團桑5號、團桑10號、團桑12號、團桑13號和團桑14號已有選育報告但未審定，團桑1號、團桑3A號、團桑7號、團桑8號、團桑15號和團桑16號作為育種材料保存。為了更好地了解并利用這些資源，本研究采用ISSR分子標記對18份團桑資源進行了遺傳多樣性分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料取自四川省絲綢科學研究院資源圃（表1）。

表1 供試材料表Table 1 Name of materials used

1.2 DNA提取及質量檢測

桑樹基因組DNA采用稍加改進的CTAB法［5］，從0.15 g硅膠干燥的桑葉中提取。取3 μL提取到的DNA，在1%瓊脂糖凝膠電泳20 min，電泳完畢后先后用紫外反射透射儀和微量紫外分光光度計檢測DNA的質量和濃度，將合格的DNA置于-20℃保存。

1.3 ISSR引物來源及篩選

參考英屬哥倫比亞大學2006年公布的ISSR引物序列和已有的ISSR在桑樹方面的研究結果［6］，選擇42個引物，由上海生工生物股份有限公司合成。以2份桑種質基因組DNA為模板，對42個引物進行PCR擴增，篩選出擴增條帶多且清晰的引物用于后續實驗。

1.4 ISSR-PCR反應及產物檢測

PCR反應在Thermal Cycler（上海山富科學儀器有限公司）上進行。PCR反應體系（10 μL）如表2，PCR反應程序參照參考文獻［6］。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min后，用紫外反射透射儀觀察并拍照保存，用于后續的數據整理。

1.5 數據分析

手工記錄不同遷移率條帶。同一遷移率，根據條帶的有無分別記為“1”和“0”，在Excel中形成數據矩陣，根據Nei's方法［7］，用Popgene32軟件［8］評價引物的擴增效果，并采用非加權組平均法UPGMA對24份供試材料進行聚類分析。

表2 PCR反應體系（10 μL）Table 2 PCR reaction system（10 μL）

2 結果與分析

2.1 24份供試桑基因組DNA的ISSR擴增的多態性

從42條引物中篩選出9條擴增條帶清晰的引物進行正式實驗，9條引物共擴增出56條清晰條帶，其中55條為多態性條帶，多態性比率為98.21%；平均每條引物擴增出6.22條條帶，其中6.11條為多態性條帶；引物ID8擴增出的條帶數最多為8條，多態性100%，引物ID6擴增出的條帶數最少為4條，也全部具有多態性；所有引物擴增出的片段大小為200～2000 bp（圖1，表3）。

表3 9條ISSR引物擴增結果Table 3 Amplification results of 9 ISSR primers

2.2 24份供試桑基于ISSR分子標記的聚類分析

以9條引物擴增的55條多態性條帶為基礎，利用Popgene32軟件計算每份種質桑間的遺傳相似系數和遺傳距離。結果表明，24份供試桑的遺傳相似系數為0.4643～0.9107，遺傳距離為0.0935～0.7673。聚類分析圖（圖2）中，首先分出的是團桑14號，其余23份桑聚為一個大支，這一大支分為5個分支：團桑1號、團桑11號、團桑6號、團桑9號、團桑10號和團桑7號在分支①；團桑2號、團桑3號、團桑4號、團桑5號、團桑8號、團桑12號、白桑、蒙桑、團桑B號和華桑在分支②；團桑13號、團桑15號和山桑在分支③；團桑16號、雞桑在分支④；團桑3A號和川桑在分支⑤。

3 小結與討論

采用9條ISSR引物對18份團桑資源和6份野生桑進行遺傳多樣性分析，共擴增出56條條帶，其中多態性條帶55條，占98.21%，平均每條引物擴增出6.22條條帶。24份供試桑的遺傳相似系數為0.4643～0.9107，遺傳距離為0.0935～0.7673。在UPGMA聚類分析中，團桑14號首先被分出，其余的23份桑聚為一個大支。團桑14號是盤桑2號（是四川省三臺蠶種場從一株30年樹齡的老桑樹上采穗，進行嫁接繁殖，從中選出的豐產性能好、桑椹多而大、春季葉片大的葉果兼用桑品種［9］）經秋水仙素誘導得到的，其單獨被分出，說明其遺傳背景與其他23份桑資源不同。

團桑6號和團桑9號聚在分支①中，這兩個品種有相同親本。團桑6號是以二倍體塘10×倫109的雜種實生苗為材料，用秋水仙堿溶液誘導其體細胞染色體加倍，經無性固定育成人工四倍體桑品種（2n=4x=56）［2］；團桑9號系從塘10×倫109 F1雜交桑的果桑株系中選出的果用桑品種［4］。

團桑13號系將二倍體塘10×倫109 F1幼苗誘導為四倍體，與二倍體四川花桑雜交而育成的雜種優勢強、產葉量高、葉質優、生長旺盛的人工三倍體［10］，與團桑15號、山桑聚在分支③中，說明團桑13號、團桑15號、山桑的親緣關系近。

團桑4號和團桑B號系四川省絲綢科學研究院從1.2萬株豐馳桑中，經過初選、復選、擴大繁殖、田間測試中選出的［11］。團桑4號葉形肥大、產葉量高、全開雌花、結果多，可作為葉果兼用品系；團桑B號葉片較肥大、產葉量高、開少量雄花。這兩個桑資源來源相同，都聚在分支②中。

聚類結果還說明團桑12號與白桑的親緣關系近，團桑B號與華桑的親緣關系近，團桑16號與雞桑的親緣關系近，團桑3A號與川桑的親緣關系近。