云斑白條天牛幼蟲腸道細菌的分離與鑒定

朱林慧，方小英，段慧娟，徐 蕾，楊振德

（廣西大學林學院，廣西南寧 530004）

云斑白條天牛（Batocera lineolata）為天牛科（Cerambycidae）多食性昆蟲，主要危害枇杷（Eriobotrya japonica）、無花果（Ficus carica）、柑橘（Citrus reticulata）、烏木（Echeveria agavoides'Ebony'）、泡桐（Paulownia fortunei）、蘋果（Malus pumila）、桃（Amygdalus persica）和核桃（Juglans regia）等[1]。其分布范圍廣，繁殖能力強，適應性強，是短周期用材林和經濟林的重要蛀干害蟲[2-3]。在中國，云斑白條天牛有害生物風險性PRA值為2.04，屬于高度危險性林業有害生物[1]。

昆蟲的腸道中存在著大量微生物，這些微生物與昆蟲聯系廣泛[4]。一些微生物與昆蟲宿主在長期協同進化中形成了緊密的共生關系[5]。昆蟲為腸道微生物提供穩定的生存環境和必要的營養物質，腸道微生物參與昆蟲體內的多種代謝過程，在昆蟲的營養、代謝和免疫等諸多生理功能上發揮重要作用[6-7]。李丹紅等[8]研究發現，不同類型白蟻的腸道細菌均在白蟻取食木材后幫助其對木材進行降解。蚜蟲共生菌（Buchnera）能產生多種氨基酸，彌補蚜蟲單一吸食植物汁液導致的營養不足[9]。

周峻沛[10]利用傳統的微生物培養方法從云斑白條天牛幼蟲的腸道內分離出100 株細菌，發現假單胞菌屬（Pseudomonas）、拉烏爾菌屬（Raoultella）和環絲菌屬（Brochothrix）為其優勢菌屬。謝谷艾等[11]分離與鑒定了松褐天牛（Monochamus alternatus）幼蟲腸道微生物，發現固氮菌在松褐天牛幼蟲腸道中普遍存在。陳金華[12]利用常規16S rDNA 克隆文庫和RFLP 分析，發現桑粒肩天牛（Apriona germari）幼蟲腸道中有豐富的微生物，優勢菌屬為克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、乳球菌屬（Lactococcus）和腸球菌屬（Enterococcus）。目前，關于云斑白條天牛具體齡級幼蟲腸道微生物尚未有報道，不同齡級間腸道微生物差異還需進一步研究。云斑白條天牛4齡幼蟲生長速度最快，取食量大，是控制其生長與危害的關鍵時期，研究此齡期的腸道微生物尤為重要。本研究采用傳統細菌培養結合16S rDNA 基因測序的方法，對云斑白條天牛4齡幼蟲腸道內的可培養細菌進行分離與鑒定，為運用生物防治云斑白條天牛的新技術提供可利用的微生物資源，也為云斑白條天牛具體齡級幼蟲腸道共生菌的進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源

2018年5—6月上旬，在廣西國有高峰林場六里分場（108°20'E，22°58'N）的桉樹林中采集云斑白條天牛4 齡幼蟲，作為樣品。該地年均相對濕度80%以上，年均氣溫19.3 ℃。

1.1.2 主要器材及試劑

主要器材為昆蟲針、解剖剪、鑷子、蠟盤、玻璃勻漿器、涂布器、接種環、高壓蒸汽滅菌鍋、高速冷凍離心機（德國Sigma 公司）、電子天平、垂直流超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）、博迅BSC-400 恒溫恒濕培養箱、細菌基因組DNA 抽提試劑盒（天根DP302）、Life Touch PCR、Nanodrop 2000 可見分光光度計和DYY-8C 電泳儀等。在南寧市羽瑞生物試劑經營部購買培養基原料、細菌基因組DNA 抽提試劑盒和其他分析純試劑，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物（27F 和1492R）。LB 基礎培養基配方參考萬倫[13]的配制方法，將10 g 蛋白胨、10 g NaCl、5 g 酵母膏和18 g 瓊脂用蒸餾水定容至1 000 mL，pH 值7.0，121 ℃滅菌20 min。去掉瓊脂后得到LB 液體培養基。

1.2 方法

1.2.1 云斑白條天牛幼蟲腸道的提取

參考周峻沛[10]的方法進行解剖。所有操作均在紫外殺菌過的超凈工作臺中進行，所用器械均進行高壓滅菌或75%酒精消毒。取健康的云斑白條天牛4 齡幼蟲放入4 ℃冰箱30 min，使其活動能力減弱，用無菌水沖洗蟲體表面雜質，再用75%酒精沖洗并浸泡3 min，隨后用無菌水沖洗3 次。在蠟盤上用昆蟲針固定蟲體，用解剖剪將蟲體剪開，用鑷子取出腸道，將腸道上連帶的脂肪等無關物質用無菌水沖洗并用鑷子撥離后放入勻漿器中，加入1 mL無菌水充分研磨，制成幼蟲腸道勻漿液。

1.2.2 腸道細菌的分離和純化

將制好的腸道勻漿液在4 ℃、4 000 rpm 條件下離心10 s，取上清液，用無菌水梯度稀釋103、104和105倍，分別取不同倍數的勻漿液各100 μL，均勻涂布在LB 培養基上，每種稀釋倍數重復3 次，以無菌水涂布及消毒后的云斑白條天牛幼蟲在平板上滾動摩擦后的平板為對照（CK）。在27 ℃培養箱中倒置培養48 h，長出菌落后，用接種環從每種稀釋梯度的培養基上挑取大小、形態和顏色有差異的單菌落，在新的LB 培養基上進行數次4 區劃線分離，直至得到純的單克隆菌株。將純的單克隆菌株接種到LB 液體培養基中，加入25%的甘油后，放置冰箱（-80 ℃）貯存備用。

1.2.3 細菌鑒定

對分離純化得到的菌株進行細菌形態及培養性狀鑒定、染色反應和生理生化特性鑒定，根據《伯杰細菌鑒定手冊》[14]和《常見細菌系統鑒定手冊》[15]進行判定。

將分離純化得到的單克隆菌株接種到LB液體培養基中，30 ℃條件下振蕩培養48 h后，取2 mL細菌懸液，11 500 r離心1 min，倒去上清液，使用細菌基因組DNA抽提試劑盒（操作步驟按說明進行）分別提取所有試驗菌株的總DNA，所提取DNA的OD260/OD280比值使用Nanodrop 2000 可見分光光度計進行測定，繼而確定DNA 純度和濃度，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶是否可以進行后續試驗。PCR擴增以提取出來的各細菌DNA為模板，以細菌通用引物為擴增引物，即正向引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG-3’）和反向引物1492R（5’-GGTTACCTTGT-TACGACTT-3’）。PCR反應體系為12.5μLMix，1.0μL27F（10mmol/L）和1.0μL1492R（10mmol/L），1.0μLDNA模板（50ng/μL）12.5 μL ddH2O。PCR反應條件為預變性條件95℃5min；進行35個循環的條件94℃30s，56℃30 s，72 ℃1 min；終末延伸條件72 ℃10 min；最后4 ℃條件下保存。PCR擴增反應結束后，利用1%瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳檢測，若檢測合格，送往北京睿博興科生物技術有限公司進行16S rDNA 基因測序。將測序結果在NCBI 平臺（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進行Nucleotide BLAST序列比對，根據數據庫中與測試菌株序列同源性最高的序列確定菌株的分類，并利用MEGA 7.0建立系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 形態鑒定

通過對云斑白條天牛幼蟲體內可培養細菌的分離與純化，共獲得14株不同的單克隆菌株（表1）。將14株菌株劃線接種到LB培養基上培養1天后，進行革蘭氏染色鑒定，根據染色結果，10 株菌株革蘭氏反應為陰性，4 株為陽性。使用油鏡觀察后發現11 株菌株形態呈桿狀，3 株呈球狀；5 株菌株有柱狀芽孢，9 株沒有；7 株菌株有周生鞭毛，1 株有端生鞭毛，1株有側生鞭毛，5株沒有鞭毛；5株菌株有莢膜，9株沒有。

表1 云斑白條天牛幼蟲腸道可培養細菌形態及培養性狀Tab.1 Morphology and culture characteristics of culturable bacteria in intestinal tracts of B.lineolata larvae

2.2 生理生化

對14株菌株進行不同的碳素化合物、氮素化合物和酶的生理生化特性鑒定，14株菌株屬于糖、醇類發酵型，且不產生色氨酸脫氨酶、苯丙氨酸脫氨酶和吲哚；除N11菌株外，其余菌株均產生過氧化氫酶；除N5菌株外，其余菌株V-P試驗均為陰性反應（表2）。

表2 云斑白條天牛幼蟲腸道內可培養細菌的生理生化特性Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of culturable bacteria in intestinal tracts of B.lineolata larvae

續表2 Continued

2.3 可培養細菌的16S rDNA 基因序列分析

將測序結果在NCBI 上進行序列比對，結合RDP數據庫Classifier分析，14種細菌分屬于9個屬，分別為芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸球菌屬、腸桿菌屬（Enterobacter）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、拉烏爾菌屬、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）、Gibbsiella和Kosakonia（表3）。其中，芽孢桿菌屬2株（N6和N8），腸球菌屬2株（N7和N11），腸桿菌屬1 株（N14），檸檬酸桿菌屬2 株（N2 和N10），拉烏爾菌屬3 株（N4、N5 和N13），蒼白桿菌屬1 株（N3），寡養單胞菌屬1 株（N1），Gibbsiella1株（N9），Kosakonia1株（N12）。

表3 云斑白條天牛幼蟲腸道內可培養細菌16S rDNA 序列比對結果Tab.3 16S rDNA sequence identification results of culturable bacteria in intestinal tracts of B.lineolata larvae

2.4 可培養細菌的系統發育分析

將測序得到的云斑白條天牛4齡幼蟲腸道內可培養細菌的16S rDNA 序列進行系統發育進化分析。結果顯示，其腸道內可培養細菌可歸類于9 個屬，5個科，分別在進化樹上形成獨立的分支（圖1）。其中，N14、N1、N2、N10、N9、N4、N5、N13和N12形成以變形菌門的γ-變形菌綱（γ-proteobacteria）為家族的大分支，除N1 屬于假單胞菌科（Pseudomonadaceae）的寡養單胞菌屬外，其余均屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的腸桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、Gibbsiella、拉烏爾菌屬和Kosakonia；N3 獨自形成以變形菌門（Proteobacteria）的α-變形菌綱（α-proteobacteria）為家族的分支，為布魯氏菌科（Brucellaceae）的蒼白桿菌屬；N6、N8、N7 和N11 形成以厚壁菌門（Firmicutes）為家族的分支，均為芽孢桿菌綱（Bacilli），分別屬于芽孢桿菌科（Bacillaceae）的芽孢桿菌屬和腸球菌科（(Enterococcaceae）的腸球菌屬。系統發育樹進一步支持了RDP Classiffier的分類結果。

圖1 基于16S rDNA序列的云斑白條天牛幼蟲腸道內可培養細菌系統發育進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of culturable bacteria in intestinal tracts of B.lineolata larvae based on 16S rDNA sequences

3 結論與討論

本研究采用傳統微生物分離培養的方法從云斑白條天牛4 齡幼蟲腸道內分離和純化出14 種細菌，通過形態觀察并結合16S rDNA 基因測序技術，鑒定出這14種可培養細菌分屬于寡養單胞菌屬、檸檬酸桿菌屬、蒼白桿菌屬、拉烏爾菌屬、芽孢桿菌屬、腸球菌屬、腸桿菌屬、Gibbsiella和Kosakonia。其中，變形菌門的拉烏爾菌屬為優勢菌屬。

本研究顯示，14株細菌中有10株歸類于變形菌門，4 株歸類于厚壁菌門，說明在門水平上，變形菌門是云斑白條天牛4齡幼蟲腸道內可培養細菌的優勢菌群。已有研究發現，鞘翅目（Coleoptera）昆蟲中，光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）[16]、暗黑鰓金龜（Holotrichia parallela）[17]和新西蘭助翅鰓金龜（Costelytra zealandica）幼蟲[18]的腸道優勢菌均為變形菌門和厚壁菌門。鱗翅目（Lepidoptera）昆蟲中的稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinawlis）[19]、舞毒蛾（Lymantria dispar）[20]、小菜蛾（Plutella xylostella）[21]以及雙翅目（Diptera）的南亞果實蠅（Bactrocera tau）[22]和柑橘大實蠅（Ceratitis capitata）[23]的腸道優勢菌也均為厚壁菌門和變形菌門。說明變形菌門與厚壁菌門是不少昆蟲體內微生物的優勢菌門，它們可能對昆蟲體內的生理代謝活動有重要影響。

云斑白條天牛4齡幼蟲體內的優勢菌屬為拉烏爾菌屬，其次是芽孢桿菌屬、腸球菌和檸檬酸桿菌屬等。有研究發現，拉烏爾菌屬中的很多種類具有降解多種環境污染物的作用，昆蟲腸道內的拉烏爾菌可能有助于昆蟲的抗藥性[24]。室內飛蝗（Locusta migratoria）種群相比于田間飛蝗種群，其后腸細菌中的優勢菌（拉烏爾菌屬）所占比例有所下降，這可能是野外昆蟲抗藥性相對較強的原因之一[25]。芽孢桿菌屬為嚴格好氧或兼性厭氧菌[26]，可消耗腸道內氧氣，使其形成厭氧環境，為有益微生物（乳酸桿菌等）的生長提供良好環境，且有較強的分泌胞外酶的能力和豐富的代謝產物[27]。腸球菌在很多昆蟲腸道微生物中均有發現，相輝等[28]發現家蠶（Bombyx mori）幼蟲腸道微生物的主要優勢菌群為腸球菌，其豐度高達82%；魯興萌等[29]研究發現在家蠶腸道中起著抵御病原微孢子蟲發芽增殖作用的是優勢菌（腸球菌）。檸檬酸桿菌屬常在雙翅目昆蟲中分布，橘小實蠅（bactrocera dorsails）[30]和南亞實蠅（Bactrocera tau）[31]的優勢菌屬均為檸檬酸桿菌屬，該類細菌為化能有機營養型，可利用糖酵解與戊糖磷酸途徑降解碳水化合物[32]。云斑白條天牛幼蟲體內相同的菌群是否具有相似的功能還需做進一步研究。

昆蟲體內微生物多樣性主要受昆蟲性別、發育齡期和種群等方面的影響[33]。暗黑鰓金龜幼蟲腸道微生物多樣性在不同齡期存在差異，其1 齡幼蟲的優勢菌門（擬桿菌門（Bacteroidetes））的豐度最高；在第2 和3 齡幼蟲中，厚壁菌門的豐度最高[34]。周峻沛[10]從江西省上饒市蟲齡不一的云斑白條天牛幼蟲胃腸道中分離和鑒定出100 株細菌，分別歸類于5個門、13 個屬，其中優勢菌門為變形菌門和厚壁菌門，優勢菌屬為假單胞菌屬、拉烏爾菌屬和環絲菌屬（Brochothrix）。本研究結果中云斑白條天牛4 齡幼蟲腸道內細菌的優勢菌門與周峻沛的結果一致。在屬的水平上，雖然均發現拉烏爾菌屬為云斑白條天牛幼蟲的優勢菌屬，但本研究未發現假單胞菌屬和環絲菌屬類型，分離鑒定出的細菌種類也較少。這可能與云斑白條天牛幼蟲的蟲齡、寄主、采集地和采集時間等的不同有關。周峻沛的采集地點為江西上饒，與廣西南寧處于不同緯度，在氣候、地形和溫度等方面均存在差異。俞英豪[35]分別對采集于江蘇南京和浙江永康的大青葉蟬（Cicadella viridis）進行腸道細菌多樣性分析，發現兩地葉蟬的腸道菌群存在明顯差異。陳金華[12]對桑粒肩天牛幼蟲的腸道多樣性進行研究，發現不同月份間細菌多樣性不同。據此推測不同采集時間導致溫度和濕度的不同，進而影響云斑白條天牛腸道的細菌組成。本研究中云斑白條天牛的寄主為桉樹，周峻沛研究的云斑白條天牛寄生于櫟屬（Quercus）植物。相對于櫟屬植物，桉樹木屑成分主要為木質素，含氮量少[36]，膳食基質的組成和含量對昆蟲腸道細菌的豐度有一定影響[37]，所以取食不同寄主的云斑白條天牛腸道微生物多樣性有差異。

很多因素影響昆蟲體內微生物的組成與豐度，系統探討造成云斑白條天牛腸道細菌差異的因素對于闡明云斑白條天牛幼蟲腸道細菌的功能、開發基于腸道細菌為靶標的生物防治藥劑具有重要意義。