Notch信號途徑對過敏性鼻炎小鼠Treg/Th17細胞免疫失衡調節的機制*

廖東， 付明亮， 高小丹， 雷錚， 曾穎， 竇艷玲， 羅利琴

(中國人民解放軍西部戰區空軍醫院 耳鼻喉頭頸外科， 四川 成都 610000)

過敏性鼻炎是自身免疫系統對非傳染性環境及物質(花粉、粉塵、毛發等)產生過度應激而引起的疾病，臨床表現為陣發性噴嚏、鼻塞、鼻癢等，嚴重者可出現過敏性鼻竇炎、支氣管哮喘等并發癥，嚴重影響患者日常生活，降低生活質量[1-2]。因此，了解過敏性鼻炎的發生發展機制有重要的臨床意義。調節性T細胞(Treg)和輔助性T細胞17(Th17)是由CD4 T細胞分化而來，Th17可招募炎性細胞，誘導細胞浸潤及組織炎性損傷，而Treg在維持免疫穩態過程中有重要作用[3]。研究表明，Treg/Th17細胞失衡與過敏性鼻炎的發生發展密切相關[4]。Notch家族是一類高度保守的跨模信號蛋白，可與配體、DNA結合蛋白、調節分子及相應的效應物組成Notch信號途徑，調控細胞發育過程[5]。近年來，越來越多的證據表明，Notch信號途徑可調控Treg/Th17細胞，參與自身免疫系統疾病的發生[6-7]。Jiao等[8]研究發現，Notch信號途徑可抑制Treg細胞分化，促進過敏性鼻炎的發展，但其具體調控機制尚不完全清楚。因此，本研究建立過敏性鼻炎小鼠模型，應用Notch信號途徑抑制劑分泌酶抑制劑(γ-DAPT)進行干預，觀察干預后小鼠Treg/Th17細胞平衡的變化，為過敏性鼻炎的防治提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及主要儀器

健康、SPF級BALB/c小鼠，6～8周齡，體質量18～22 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK(川)2019-0010，應用普通飼料適應性喂養1周。γ-DAPT(M05737-VBH，北京百奧萊博，規格10 mg)，卵清蛋白(ovalbumin，OVA，美國Sigma)，氫氧化鋁[AL(OH)3，上海源葉生物]，蛋白抗體(美國Biolegend)。流式細胞儀(FACSCalibur，美國BD)，酶標儀(iMark，美國BioRad)，熒光定量PCR儀(ABI7300，美國Thermo Fisher)。

1.2 方法

1.2.1過敏性鼻炎小鼠模型構建 將30只BALB/c小鼠隨機分為對照組、模型組及γ-DAPT組，每組10只；后2組小鼠于第1、7、14 天時腹腔注射OVA+AL(OH)3混懸液[OVA20 μg和AL(OH)32 mg溶于生理鹽水0.1 mL]致敏，第21～27天以6% OVA滴鼻(40 μL/孔)局部刺激，對照組以等量生理鹽水替代。末次局部刺激后，采用疊加打分法，觀察3組小鼠30 min內打噴嚏、撓鼻子的次數和鼻溢情況，其中1分為輕撓鼻子1～2次，打噴嚏1～3個，鼻溢至前鼻孔；2分為撓鼻面不止，打噴嚏4～10個，鼻溢超出前鼻孔；3分為劇烈撓鼻子不止，打噴嚏超過10個，鼻溢滿面；總分>5分時表明過敏性鼻炎小鼠模型復制成功[9]。γ-DAPT組于在局部刺激前30 min鼻內滴注γ-DAPT(10 μg/20 μL)，對照組和模型組以等量二甲基亞砜(γ-DAPT溶劑)替代。各組末次滴鼻后對小鼠行為學進行評分，再處死小鼠，摘眼球取血分離血清，快速分離鼻黏膜組織。

1.2.2病理染色觀察 取鼻黏膜組織，常規石蠟包埋切片后，進行常規蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，光鏡下觀察鼻黏膜組織病理變化。

1.2.3流式細胞儀檢測鼻黏膜組織Treg/Th17細胞比例 取鼻黏膜組織研磨制備細胞懸液，采用小鼠淋巴細胞分離液，經密度梯度稀釋法獲取單個核細胞懸液。取1×106個單個核細胞，加入離子霉素、莫能霉素等T細胞活化劑，再分別加入CD4、CD25抗體，避光下室溫孵育30 min，洗滌后添加固定劑和穿膜劑，再加入白細胞介素17(interleukin 17，IL-17)、叉頭狀家族轉錄因子3(forkhead transcription factor 3，Foxp3)抗體，避光下室溫孵育30 min，1 h內上流式細胞儀檢測，其中CD4+IL-17+標記為Th17細胞(右上象限)，CD4+CD25+Foxp3+標記為Treg細胞(右上象限)。

1.2.4酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清細胞因子的表達 取血清樣本，嚴格參照ELISA試劑盒說明書操作，檢測小鼠血清IL-10、IL-17和轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)的含量。

1.2.5實時熒光定量PCR檢測mRNA的表達 取鼻黏膜組織加入Trizol，提取總RNA，逆轉錄合成cDNA模板，再進行實時熒光定量PCR擴增，以β-actin為內參，計算Notch1、配體分子Jagged1及下游產物Hes1 mRNA的表達。目的基因引物由上海杰美基因提供，其中Notch1上游引物序列5′-TGCCAGTATGATGTGGATGAG-3′，下游引物序列5′-GGTCCCCTGTGTAACCTTCTGT-3′；Jagged1上游引物序列5′AGTAAACGGGATGGAAACAGC-3′，下游引物序列5′-AGCAGAGGAACCAGGAAATCT-3′；Hes1上游引物序列5′AGCCCACCTCTCTCTTCTGAC-3′，下游引物序列5′-AGGCGCAATCCAATATGAAC-3′；β-actin上游引物序列5′-GTCGTACCACAGGCATTGTGTAGG-3′，下游引物序列5′-GGAATGCCTGGGTACATGGTGG-3′[10]。

1.2.6蛋白印跡(Western blot)方法檢測蛋白的表達 取鼻黏膜組織加入裂解液，提取總蛋白，檢測各樣本蛋白濃度，取40 μg蛋白點樣至SDS-PAGE凝膠進行蛋白分離，再轉移至PVDF膜上、加入5%脫脂奶粉封閉1.5 h、分別加入蛋白一抗，4 ℃下孵育過夜，各一抗稀釋比為：Notch1(1 ∶200)、Jagged1(1 ∶200)、Hes1(1 ∶800)及β-actin(1 ∶1 000)；次日再加入辣根酶標記的蛋白二抗(1 ∶10 000)，室溫下孵育1 h，最后經凝膠成像系統顯影，以β-actin為內參，計算各蛋白的相關表達量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 行為學評分及鼻黏膜組織學

行為學評分結果顯示，對照組小鼠無噴嚏、撓鼻子及清水涕癥狀；模型組頻繁撓鼻子，噴嚏和清水涕較多；γ-DAPT組較模型組噴嚏、撓鼻子及清水涕癥狀明顯減輕。與對照組比較，模型組行為學評分升高(P<0.05)；與模型組比較，γ-DAPT組行為學評分降低(P<0.05)，見表1。鼻黏膜組織學觀察結果顯示，與對照組比較，模型組鼻黏膜上皮細胞排列紊亂，有明顯的水腫和炎性細胞浸潤；與模型組比較，γ-DAPT組鼻黏膜上皮細胞排列趨于整齊，水腫和炎性細胞浸潤情況明顯好轉，如圖1。

表1 各組小鼠行為學評分比較Tab.1 Comparison of behavior scores in each group

對照組 模型組 γ-DAPT組圖1 各組小鼠鼻黏膜組織學觀察(HE，×200)Fig.1 Comparison of pathological changes in nasal mucosa tissues in each group (HE，×200)

2.2 鼻黏膜組織Treg/Th17細胞比例

如圖2、表2顯示，與對照組比較，模型組小鼠鼻黏膜組織Th17細胞比例增多，Treg細胞減少(P<0.05)；與模型組比較，γ-DAPT組Th17細胞比例減少，Treg細胞增多(P<0.05)。

圖2 各組小鼠鼻黏膜組織Treg及Th17細胞比例Fig.2 Proportions of Treg and Th17 cells in nasal mucosa tissues of all groups

表2 各組小鼠鼻黏膜組織Treg及Th17細胞比例Tab.2 Proportions of Treg and Th17 cells in nasal mucosa tissues in each group

2.3 血清細胞因子IL-10、TGF-β及IL-17水平

與對照組比較，模型組小鼠血清IL-10、TGF-β水平降低，IL-17水平升高(P<0.05)；與模型組比較，γ-DAPT組IL-10、TGF-β水平升高，IL-17水平降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠血清細胞因子IL-10、TGF-β及IL-17水平Tab.3 Comparison of serum IL-10,TGF-β and IL-17 in each group

2.4 鼻黏膜組織Notch1、Jagged1及下游Hes1表達

與對照組比較，模型組小鼠鼻黏膜組織Notch1、Jagged1及下游Hes1 mRNA及蛋白表達上調(P<0.05)；與模型組比較，γ-DAPT組Notch1、Jagged1及下游Hes1 mRNA及蛋白表達下調(P<0.05)。見圖3及表4、表5。

表4 各組小鼠鼻黏膜組織Notch1、Jagged1及下游Hes1 mRNA表達Tab.4 Expression of Notch1, Jagged1 and downstream Hes1 mRNA in nasal mucosa tissues in each group

表5 各組小鼠鼻黏膜組織Notch1、Jagged1及下游Hes1 蛋白表達Tab.5 Expression of Notch1, Jagged1 and downstream Hes1 proteins in nasal mucosa tissues in each group

圖3 各組小鼠鼻黏膜組織Notch1、Jagged1及下游Hes1 蛋白的表達Fig.3 Expression of Notch1, Jagged1 and downstream Hes1 proteins in nasal mucosa tissues in each group

3 討論

關于過敏性鼻炎的經典免疫學說認為，Th1/Th2細胞免疫失衡是引起鼻黏膜變應性反應的主要因素，但Th1/Th2細胞失衡并無法完全解釋其致病過程。Treg和Th17細胞是新發現CD4 T細胞亞群，可共同調節機體免疫耐受穩定，參與過敏性鼻炎的發生發展[11]。Foxp3是Treg細胞的標志性分子，可誘導細胞分泌IL-10和TGF-β，下調效應性T 細胞、單核巨嗜細胞等細胞功能[12]。Th17細胞可參與固有免疫和適應性免疫，分泌因子IL-17，強效募集中性粒細胞，并促進多種細胞的分化及成熟，影響免疫功能和組織損傷程度[13]。近期研究表明，Notch信號途徑可調控Treg/Th17細胞，參與機體疾病的發生[14]。Notch信號途徑廣泛存在于多種細胞中，如巨噬細胞、造血細胞等，介導細胞分化、增殖和凋亡等過程[15]。而在免疫系統中，Notch信號途徑可參與T細胞的產生、分化及功能調控[16]。Notch信號途徑主要由Notch受體、配體、CSL DNA結合蛋白、調節分子及相應的效應物組成。當Notch受體胞外部分轉移至細胞膜，結合配體后將啟動Notch信號途徑，激活下游產物(Hes1、Hey等)表達，因而調控細胞發育過程[17]。而且焦沃爾等[18]研究發現，Notch受體與配體在過敏性鼻炎的發病中高表達，可能介導細胞炎性因子促進其發生發展。因此推測，Notch信號途徑在過敏性鼻炎中的調控機制，可能與Treg/Th17細胞失衡有關。

尤宏銀等[19]報道，過敏性鼻炎患者體內存在明顯的Treg/Th17免疫失衡。本研究通過OVA+AL(OH)3誘導過敏性鼻炎模型，刺激后小鼠出現明顯的噴嚏、撓鼻子及清鼻涕癥狀，符合過敏性鼻炎的臨床特點。同時，模型小鼠鼻黏膜組織中Th17細胞比例及血清IL-17水平升高，Treg細胞及其分泌因子IL-10、TGF-β水平降低，提示過敏性鼻炎小鼠鼻黏膜內存在明顯的Treg/Th17免疫失衡，與Gu等[20]造模結果相符。而且模型小鼠中Notch1、Jagged1及下游Hes1 的表達上調，進一步證實Notch信號途徑參與過敏性鼻炎的發生發展。

γ-DAPT是γ-分泌酶的抑制劑，可通過抑制組成型酶切活動，阻斷Notch信號傳遞[21]。Yu等[22]分離免疫相關性血小板減少癥患者外周血單個核細胞，經γ-DAPT處理后，明顯抑制Th17細胞功能，提示Notch信號途徑參與免疫相關性血小板減少癥患者Th17調節。

終上所述，本研究應用γ-DAPT干預模型小鼠后，Notch1、Jagged1及下游Hes1 的表達下調，提示γ-DAPT成功阻斷Notch信號途徑，而小鼠Th17細胞比例及血清IL-17水平降低，Treg細胞及其分泌因子IL-10、TGF-β水平升高，表明在過敏性鼻炎小鼠中阻滯Notch信號途徑，可抑制Th17細胞，促進Treg細胞，這與既往研究結果相似[23]。同時，行為學和鼻黏膜病理觀察結果也顯示，干預γ-DAPT后，小鼠噴嚏、撓鼻子及清鼻涕癥狀減少，鼻黏膜組織損傷減輕，可能與γ-DAPT糾正Treg/Th17細胞失衡有關。故Notch信號途徑可能參與過敏性鼻炎的致病機制，其抑制劑γ-DAPT可糾正Treg/Th17細胞免疫失衡，從而減輕過敏性鼻炎癥狀，選擇性阻斷Notch信號途徑，有望成為過敏性鼻炎的治療靶點。