順鉑處理的肺癌細胞NSUN2 mRNA剪接異構體變化*

吳小海， 劉曉曉， 張宏偉， 李夢仙， 溫艷萍， 李明陽， 吳翰欣， 張沛， 俞建昆**

(1.昆明醫科大學 中國醫學科學院醫學生物學研究所， 云南 昆明 650000； 2.中國醫學科學院 & 北京協和醫學院 醫學生物學研究所， 云南 昆明 650118； 3.昆明醫科大學 第二附屬醫院， 云南 昆明 650000)

肺癌是目前人類發病率和死亡率最高的癌癥之一，但發病機制尚不清楚[1-2]。順鉑(Cis-diaminodichloroplatin,CDDP)是一種廣泛運用在癌癥臨床治療中的鉑類化療藥物，可使細胞的DNA產生交聯，從而誘導細胞凋亡，達到殺死腫瘤細胞的目的[3]。用CDDP處理細胞，隨著用量的提高，細胞的凋亡水平亦越高，各種基因的表達調控也隨之變化[4]。哺乳動物細胞前體mRNA(pre-mRNA)選擇性剪接被認為是轉錄后基因表達調控的一個重要層面，可以調控不同組織和疾病狀態下基因的表達模式，異常的選擇性剪接則與癌癥有關，可調節蛋白的表達量或產生多種蛋白異構體，也可能產生一些截短的甚至功能相反的蛋白質，從而影響細胞的凋亡和耐藥性[5-6]。NOP2/Sun RNA甲基轉移酶2(NOP2/Sun RNA methyltransferase 2，NSUN2)是一種RNA甲基修飾酶，能把S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine, SAM)的甲基轉移到RNA上胞嘧啶的5號位點上，使胞嘧啶甲基化成5甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，m5C)[7-9]，這種甲基化修飾方式在tRNA穩定性、RNA轉運調節及mRNA轉錄后水平調控等方面有重要作用[10-13]；NSUN2還能通過多種通路促進癌細胞的生長[14-15]，并在細胞抵抗氧化壓力時發揮重要應激作用[16]。RNA的甲基化是一種非常重要的轉錄后調控方式，是表觀轉錄組學的主要部分[17]，RNA甲基化廣泛存在于各種RNA中[18-19]，其中N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)甲基化研究較多，m5C甲基化研究則較少，而RNA的m5C甲基化修飾存在于幾乎所有類型的RNA中，其表達水平異常與腫瘤、神經系統缺陷、心血管系統疾病和異常分化等疾病密切相關[20]。因此有必要對RNA m5C甲基化的關鍵基因NSUN2的調控方式進行研究，NCBI的數據庫顯示NSUN2存在多個mRNA剪接異構體，本研究擬通過檢測分析在順鉑處理的肺癌細胞系和肺癌臨床樣本中NSUN2 pre-mRNA的剪接變化，為探究NSUN2的pre-mRNA選擇性剪接調控提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞和標本 人肺癌細胞系H1299細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，人肺癌細胞系A549細胞購自中國科學院昆明動物所細胞中心；選取2018年1—6月胸外科非小細胞肺癌患者的腫瘤組織及其癌旁正常組織，肺癌的診斷經組織病理學證實，共納入患者16例，男性8例、女性8例，年齡42～70歲、平均(56.9±7.3)歲，腫瘤直徑>3cm 9例、腫瘤直徑≤3cm 7例，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期12例、Ⅲ～Ⅳ期4例。

1.1.2主要藥品和儀器 RPMI-1640細胞培養液(美國Corning，批號10040014)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；以色列Biological Industries，批號1534372)，CDDP(昆明貴研藥，批號S20161003)，RNAiso Plus(日本TakaRa，批號AKA4302)、oligo(dT)23及Hiscript Ⅱ逆轉錄酶(南京Vazyme，批號7E250B8)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(上海捷瑞，批號GR301G11X)，5 min TM TA/Blunt-Zero 克隆試劑盒(南京Vazyme，批號7E260K8)，質粒小提試劑盒(北京天根生化科技有限公司，批號s7605)及ChemiDoc MP凝膠成像儀(美國BIO-RAD)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養和分組 人肺癌細胞系A549細胞和H1299 細胞使用含100 000 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和10%FBS的RPMI-1640細胞培養液于37 ℃、5%CO2環境下培養至對數增長期；DMSO避光溶解CDDP后按梯度濃度分別加入各組細胞的培養基中處理細胞，按加入CDDP濃度的不同，A549細胞分為0、8、16、24、32、40、48及56 μmol/L共8組，H1299細胞則分為0、12、24、36、48、60、72及84 μmol/L共8組。

1.2.2細胞和標本組織的NSUN2 各mRNA剪接異構體的表達 采用逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測，取CDDP處理24 h后各組細胞，棄培養液，預冷PBS沖洗，除去PBS，加RNAiso Plus吹打，至細胞充分裂解；同時臨床標本組織塊在RNAiso Plus中勻漿至充分裂解，分別按照試劑說明書程序提取細胞和臨床標本組織總RNA。以oligo(dT)23為引物，用Hiscript II逆轉錄酶進行逆轉錄反應得到cDNA；在NSUN2 pre-mRNA剪接形式多樣的位置設計引物NSUN2 F為CACCACTGCTCCTCAACGTG，NSUN2 R為CTCTTGGCTTGATGGACGAGC；加入等量cDNA模板，反應總體積15 μL，擴增程序為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s、62 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s，循環35次，最后72 ℃終延伸5 min；2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產物，并用ChemiDoc MP凝膠成像儀成像自帶分析軟件(Impage Lab)對各個目標條帶進行定量。

1.2.3RT-PCR產物的TA克隆(original TA cloning kit)與測序 切下含有RT-PCR產物目的條帶的瓊脂糖凝膠塊，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行回收，用5 min TM TA/Blunt-Zero克隆試劑盒將回收的目的片段與含有氨芐青霉素抗性基因的載體進行連接，構建好的質粒轉化入DH5α 感受態細胞，再用含有氨芐青霉素的LB培養基篩選陽性克隆，將其擴大培養后用質粒小提試劑盒提取質粒，進行一代測序(Sanger法)得到每個RT-PCR產物的DNA序列。

1.2.4生物信息網站比對 將RT-PCR產物測序結果與生物信息網站(NCBI：https://www.ncbi.nlm.nih.gov；UCSC：http://genome.ucsc.edu/)數據進行比對，根據目前公開發表的數據信息顯示，NSUN2的mRNA剪接異構體只有4種：不可編碼蛋白的異構體A不含第6、7外顯子、可編碼蛋白的異構體B和C只保留第6外顯子、會產生提前終止密碼子(premature termination codon, PTC)，而不可編碼蛋白的異構體D只保留第7外顯子(圖1)。

1.2.5核酸序列比對和翻譯 使用Lasergene中的Megalign軟件比對RT-PCR產物序列和其可能編碼的氨基酸序列，使用Lasergene中的Editseq軟件將mRNA剪接異構體的全長編碼序列(coding sequence，CDS)翻譯成氨基酸序列，觀察是否有PTC出現。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 細胞NSUN2 mRNA剪切異構體的變化

mRNA剪接異構體檢測引物NSUN2 (F,R)分別設計在NCBI編號NM_017755.6的mRNA(異構體B)的第5外顯子(exon5)和第7外顯子(exon8)上，目的條帶為102 bp(異構體A)、187 bp(異構體B、C)及244 bp(異構體D，圖1)；RT-PCR檢測結果顯示，肺癌細胞系中NSUN2可編碼蛋白的mRNA剪接異構體B和C(187 bp)的表達量最高，在NSUN2總mRNA的表達中占主導地位，非編碼mRNA剪接異構體A(102 bp)表達量極少，出現了一條330 bp左右的不明條帶(圖2A和2B)，該不明條帶在隨后測序鑒定中確定為未見報道的mRNA剪接異構體E(329 bp)和F(331 bp)。RT-PCR產物各條帶的量化結果顯示，與CDDP濃度0 μmol/L的對照組比較，隨著加入CDDP濃度的升高，NSUN2可編碼蛋白的mRNA剪接異構體B和C(187 bp)在A549細胞中表達量變化不明顯，在H1299細胞的60 μmol/L及更高濃度處理組中表達量下降，差異有統計學意義(P<0.01)；非編碼蛋白的mRNA剪接異構體D (244 bp)，在A549細胞的40 μmol/L及更高濃度處理組、H1299細胞的36 μmol/L及更高濃度處理組中表達量上升，差異有統計學意義(P<0.05)；未見報道的mRNA剪切異構體E和F(329/331 bp)，在A549細胞的32 μmol/L及更高濃度處理組、H1299細胞的36 μmol/L及更高濃度處理組中表達量上升，差異有統計學意義(P<0.05，圖2C和2D)。

注：方框為外顯子，橫線為內含子，灰、白色分別表示以外顯子為編碼蛋白和非編碼的mRNA剪接異構體；A～F為異構體編號，1～8為外顯子編號，第7外顯子長度有142 bp和144 bp；箭頭表示引物設計位點。圖1 NSUN2 mRNA的剪接異構體及引物設計位點Fig.1 Splicing isoforms of NSUN2 mRNA and primer design sites

注：A、B分別為梯度濃度CDDP處理的A549和H1299細胞中NSUN2的RT-PCR產物圖(上為增強曝光，下為正常曝光；M為100 bp ladder maker)，C、D分別為A549和H1299中各目的條帶相對表達量；與0 μmol/L CDDP比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖2 不同濃度CDDP處理A549和H1299細胞中NSUN2 mRNA剪接異構體的表達(RT-PCR)Fig.2 Expressions of NSUN2 mRNA isoforms in A549/H1299 cells treated by cisplatin(RT-PCR)

2.2 肺癌臨床樣本中NSUN2 mRNA剪切異構體的變化

RT-PCR結果顯示，肺癌臨床樣本中檢測到了102、187、244和329/331 bp大小的RT-PCR產物條帶，其中可編碼蛋白的mRNA剪接異構體B和C(187 bp)的表達量最高，在NSUN2總mRNA的表達中占主導地位，未見報道的2種NSUN2 mRNA剪切異構體E和F(329/331 bp)在癌組織與癌旁組織中均有微弱表達。在所檢測的16例肺癌患者中，多數患者癌組織與癌旁正常組織中NSUN2 mRNA剪切異構體的表達存在差異，少數患者沒有明顯變化(圖3)。

注：數字為患者編號，C為癌組織，N為癌旁組織；M為100 bp ladder maker。圖3 肺癌組織標本中NSUN2 mRNA剪接異構體的表達(RT-PCR)Fig.3 Expressions of NSUN2 mRNA splicing isoforms in lung cancer tissue samples(RT-PCR)

2.3 未見報道的NSUN2mRNA剪接異構體的測序鑒定

H1299細胞RT-PCR產物中330 bp左右的條帶進行切膠回收并測序(圖4)，確定該條帶為同時保留圖1中第6、7外顯子的異構體E(329 bp)及異構體F(331 bp)2種未有報道的mRNA剪接異構體，異構體F在exon7前多剪接進了2個堿基(圖4B)，剪接異構體E和F在NCBI、UCSC網站數據中均未見報道。

注：A為異構體A～E的序列對比，B為異構體F與E的序列對比。圖4 NSUN2 mRNA剪接異構體的核酸序列對比Fig.4 Nucleic acid sequence comparison of NSUN2 mRNA splicing isoforms

2.4 NSUN2未有報道的mRNA剪切異構體編碼蛋白質情況

結果顯示，NSUN2 未見報道的mRNA剪接異構體E無論是否含有exon3均會產生提前PTC，無法編碼完整蛋白質，預測異構體E-1含exon3、CDS共2 446 bp在第664～666位會產生“TGA”提前PTC，異構體E-2不含exon3、CDS共2 341 bp在第559～561位會產生“TGA”提前PTC(圖5A)；剪接異構體F無論是否含有exon3均可以編碼完整蛋白質(圖5B)，預測異構體F-1含exon3、CDS共2 448 bp可編碼816個氨基酸，異構體F-2不含exon3、CDS共2 343 bp可編碼781個氨基酸(表1)。

表1 NSUN2 mRNA剪接異構體F可能編碼的蛋白序列Tab.1 The possible scriptable protein sequence by NSUN2 mRNA splicing isoform F

注：A為異構體E、包含exon3與不含exon3的氨基酸序列對比，B為異構體F、含exon3與不含exon3的氨基酸序列對比。圖5 NSUN2 mRNA剪接異構體E和F可能翻譯的氨基酸序列對比Fig.5 Comparison of possible translatable amino acid sequence by the NSUN2 mRNA splicing isoform E and F

3 討論

對RNA的m5C甲基化修飾的初步研究揭示其在基因轉錄后表達調控中有著重要作用，而NSUN2是RNA m5C修飾的關鍵基因[10]。引物NSUN2 (F，R)在人肺癌細胞系A549細胞和H1299細胞中檢測到了5種mRNA剪接異構體，加上包含和不包含exon3的2種情況，可能存在8種mRNA剪接異構體，這些異構體在不同組織和不同疾病中是否有不同的表達情況和功能差異，值得進一步研究探討。從檢測結果來看，人肺癌細胞系A549細胞和H1299細胞中，編碼NSUN2蛋白的mRNA剪接異構體B、C占主導地位，在CDDP處理下與CDDP濃度0 μmol /L的對照組比較，隨著CDDP濃度的升高，細胞的凋亡程度加劇，這2種異構體在A549細胞中表達量變化不顯著，在H1299細胞的60 μmol/L及更高濃度處理組中表達量下降；非編碼蛋白的mRNA剪接異構體D 在A549細胞的40 μmol/L及更高濃度組和H1299細胞的36 μmol/L及更高濃度組中表達量上升；未有報道的mRNA剪切異構體E和F在所檢測的2種細胞系中的表達量比較低，在A549細胞的32 μmol/L及更高濃度組和H1299細胞的36 μmol/L及更高濃度組中表達量上升。細胞在應激條件下的基因表達和正常狀態下不同，且基因的表達調控是多級干預的高度動態的生物過程[21-23]。細胞在壓力下許多基因pre-mRNA的選擇性剪接會發生變化，一些異構體升高，而另一些異構體下降，有些異構體會因pre-mRNA的剪接變化造成讀碼框移動從而產生PTC，這些含有PTC的mRNA 剪接異構體會被mRNA表達監控機制NMD(無義介導的mRNA降解nonsense-mediated mRNA decay)所降解，如果基因的pre-mRNA剪接變化是使含PTC的異構體比例升高，而不含PCT的能編碼蛋白的異構體下降，這樣會降低編碼蛋白的mRNA水平，下調該基因的表達水平[24-25]。本文結果提示NSUN2在CDDP處理的肺癌細胞中的表達可能就是通過這一機制來調控的。

異構體E和F(RT-PCR產物329/331 bp)在肺癌臨床樣本中也有表達，說明異構體E和F不只是在細胞系中表達，但癌組織里和癌旁組織里的異構體E和F表達量沒有顯著差別，而在高濃度CDDP處理的肺癌細胞系中異構體E和F的表達量升高，它們是否有一定功能有待進一步研究。異構體E和F在測序確定了mRNA序列后進一步的預測其氨基酸序列，明確了異構體E含有PTC不能編碼完整蛋白，而剪切異構體F可以編碼完整蛋白質。在本研究的RT-PCR產物329/331bp條帶中是異構體E和F的哪一種占主導，也待進一步研究分析，而異構體F可能翻譯出的蛋白質究竟有何功能，還有待研究。

綜上所述，NSUN2對mRNA的m5C甲基化修飾是基因轉錄后調控的一種重要方式，因此該基因的表達調控是值得關注的研究方向。本研究結果提示，NSUN2基因在CDDP處理下，其pre-mRNA在選擇性剪接層面上存在一定的表達調控，該基因的選擇性剪接調控值得進一步研究探討。