煅燒骨與羧甲基殼聚糖復合材料修復家兔下頜骨缺損的成骨效果*

廖健，張霽文，程余婷，姚超，周倩，霍花，劉官娟

(1.貴州醫科大學附屬口腔醫院 修復種植科， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學 口腔醫學院， 貴州 貴陽 550004； 3.貴陽市口腔醫院， 貴州 貴陽 550002)

牙槽骨因腫瘤、炎癥、外傷或發育不良等原因造成的骨量不足是口腔種植中的常見問題[1]，目前主要采用骨移植材料來增加牙槽骨骨量，骨移植材料來源主要有自體骨、同種異體骨、異種骨及其它人工合成骨[2]。自體骨作為骨移植材料的“金標準”，移植效果最為理想[3-4]，但存在需要開辟第二術區、增加患者痛苦及感染風險的問題；而異體骨和異種骨又可能攜帶病原體或在植入后發生免疫反應，并且處理成本相對較高，應用受到一定限制；人工合成骨替代材料，如羥基磷灰石、高分子聚合物、膠原、磷酸鈣等，雖來源廣泛，但成本及生產制造要求也相對較高，并且一部分合成材料在植入后吸收率較低，較難被自身組織所替代，影響骨組織的新生改建。因此各種骨替代材料均存在不可忽視的缺點[6]，各種單一骨移植材料尚不能滿足廣大患者的需求[7]。理想的骨替代材料通常需具有良好的生物降解性及相容性、無免疫原性或低免疫原性、骨傳導和骨誘導作用、一定的機械強度、能在植入后起到支架作用并保持穩定、利于新生組織沿其支架結構生長、能制備成各種形狀、利于新生組織生長成所需的外形、利于細胞黏附生長的三維結構及高孔隙率等特點[8-10]。本課題組前期實驗中將煅燒骨與殼聚糖復合制備得到煅燒骨/殼聚糖(CB/CS)復合材料，通過理化性能檢測表明該復合材料的主要成分為羥基磷灰石和β-磷酸三鈣，具備良好的三維結構及高孔隙率、合適的抗壓強度及安全無毒[11]，體外細胞實驗證實該復合材料具有誘導骨髓間充質干細胞向成骨分化的作用[12]。本研究以前期的實驗結果作為基礎，將復合材料植入家兔體內，對植入后不同時點的成骨效果進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要儀器和試劑 煅燒骨粉(calcined bone，CB)由四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室生物材料中心提供)，Bio-oss骨粉(Geistlich，Switzerland)、羧甲基殼聚糖( carboxymethyl chitosan，CMC)由上海德默醫藥科技提供，京尼平(之信生物科技)，無水乙醇(重慶川東化工)，恒溫磁力攪拌器(江蘇金壇大地自動化儀器廠)，實驗室超純水機(四川沃特爾科技)，真空干燥機(日本東京理化， PDU-11003060600)顯微CT(Micro-CT，μCT 50)由四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室提供。

1.1.2實驗動物 spf級家兔60只，體質量2.0～2.5 kg，月齡2～4月，由貴州醫科大學動物實驗中心提供。

1.2 方法

1.2.1復合材料的制備 按照羧甲基殼聚糖與骨粉的質量比為1 ∶1的比例，采用溶液共混的方法，以京尼平為交聯劑制備CB/CS復合材料及Bio-oss/羧甲基殼聚糖復合材料，真空干燥成型后待用。

1.2.2分組及方法 取健康成年家兔60只，隨機分為1個實驗組和4個對照組，每組12只。各組家兔均制作骨缺損模型(如圖1)，無菌條件下選取家兔一側下頜骨作為術區，暴露下頜骨體部，鉆孔制作直徑約5 mm、深約2 mm的骨缺損區。實驗組下頜骨缺損區植入CB/CS復合材料，4個對照組中取3組分別植入單純CB、Bio-Oss及Bio-oss/CMC復合材料，植入材料均約為0.1 g，以填滿骨缺損區為準，剩余1個組為不植入任何材料的空白組。術后止血分層縫合肌層、皮下組織及皮膚，術后注射青霉素以抗感染，術后1、2 d時行術區換藥，觀察術區傷口愈合情況。分別于術第后第2、4、8及12周時每組各處死家兔3只，取出術區標本進行檢查。

圖1 骨缺損區的制備及植入骨移植材料Fig.1 Establishment of bone defects and implantation of bone graft material

1.3 觀察指標

1.3.1肉眼觀察 觀察骨缺損區內骨質生長情況。

1.3.2Micro-CT掃描 將標本置入10%甲醛溶液中，4 ℃冰箱內固定48 h，使用Micro-CT(μCT 50)掃描，掃描電壓70 kV，電流200 μA，掃描層厚24 μm。使用SCANCO Evaluation進行分析，取感興趣區域(region of interest，ROI)骨密度(bone mineral density，BMD)、骨小梁厚度或孔壁厚度(trabecular Thickness，Tb.Th)、骨小梁分離度或孔隙率(trabecular separation/spacing，Tb.Sp)及骨小梁數量(trabecular number，Tb.N)值進行分析。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 術后大體觀察

術后第2周，CB/CMC復合材料組3只家兔的骨缺損區均觀察到材料與周圍骨質聯結緊密，邊界尚清，質地較硬，從表面上看材料未見明顯吸收；Bio-oss/CMC復合材料組3只家兔的骨缺損區均觀察到材料與周圍骨質聯結緊密、邊界尚清、質地較硬，但表面材料有部分吸收，煅燒骨與周圍骨質聯結緊密、邊界尚清、質地偏硬、表面未見骨粉吸收；Bio-oss骨粉組3只家兔的骨缺損區均觀察到材料與周圍骨質聯結緊密，邊界清、質地偏硬，表面可見部分骨粉吸收；空白缺損組3只家兔的骨缺損區均未見愈合，大小相較于手術當天略有縮小，缺損區內可探及少量質軟的纖維結締組織(圖2)。

術后4周，CB/CMC復合材料組3只家兔的骨缺損區均觀察到材料與周圍骨質聯結緊密、質地較硬，表面可見部分材料吸收并被新生骨質生成替代；Bio-oss/CMC復合材料組3只家兔的骨缺損區均觀察到材料與周圍骨質聯結緊密，質地較硬，表面可見少量新生骨質覆蓋；煅燒骨粉組3只家兔的骨缺損區均觀察到材料與周圍骨質聯結緊密、邊界尚清、質地硬，邊緣可見少量新生骨質生成；Bio-oss骨粉組3只家兔的骨缺損區均觀察到材料與周圍骨質聯結緊密，周圍新生骨質量少，骨粉顆粒未見明顯吸收；空白組3只家兔的骨缺損區均未愈合，并被大量質地較軟的纖維結締組織占據(圖2)。

術后第8周，CB/CMC復合材料組3只家兔的骨缺損區均觀察到表面基本吸收，完全被新生骨質所替代，并已形成皮質骨；Bio-oss/CMC復合材料組3只家兔的骨缺損區均觀察到表面仍可見植入材料存在，大量新生骨質覆蓋，質硬；煅燒骨組3只家兔的骨缺損區均觀察到表面骨粉顆粒未完全吸收骨粉吸收，可見有新生骨質生長于其上；Bio-oss骨粉組3只家兔的骨缺損區均觀察到表面顆粒未完全吸收，有新生骨質生產與植入材料表面，新生骨質量多于術后4周時；空白組3只家兔的骨缺損區均未愈合，大量纖維結締組織占據其中(圖2)。

術后第12周，CB/CMC復合材料組3只家兔的骨缺損區均觀察到表面基本被新生骨質所替代，骨質連續完整；Bio-oss/CMC復合材料組3只家兔均觀察到缺損區較術后4周、8周時已明顯縮小，中央部仍見材料存留；煅燒骨組3只家兔均觀察到缺損區已明顯縮小，少量材料未吸收，大部分材料被新生骨質替代；Bio-oss骨粉組3只家兔均觀察到缺損明顯縮小，中央處仍有骨粉材料未吸收，邊緣處骨粉材料已基本被新生骨質替代；空白組3只家兔的骨缺損區均未見愈合，且其內仍可探及纖維結締組織(圖2)。

圖2 各組不同時間點骨缺損部位觀察Fig.2 Observation of bone defect sites at different time points in each group

2.2 Micro-CT檢測

術后第2周，CB/CMC組、Bio-oss/CMC組、煅燒骨組及Bio-oss骨組缺損區內均可見顆粒樣組織，缺損區邊界清楚。術后第4周，CB/CMC組缺損區邊緣部骨粉顆粒與周圍骨組織界限模糊，缺損區內顆粒樣影尚存；但密度較術后第2周時明顯增加，其它對照組與術后第2周時無明顯差異。術后第8周，CB/CMC組缺損區范圍明顯縮小，僅見少量顆粒樣影存在，大部分為與周圍骨質相同的影響；而對照組缺損區內仍可見大量顆粒樣影，但密度較術后第4周時明顯增加，缺損區邊界也開始模糊。術后12周，CB/CMC組缺損區已基本消失，取而代之的是與周圍骨質相同的影響；而Bio-oss/CMC組、煅燒骨組、Bio-oss骨組缺損區較術后第8周時有明顯縮小，缺損區內也可見與周圍骨質相同的成片狀的影響，但仍存在少量的顆粒樣影(圖3)。

圖3 各組不同時間點骨缺損部位Micro-CT掃描圖像Fig.3 Micro-CT scanning images of bone defect sites at different time points in each group

2.3 BMD

術后第2、4、8及12周時各組BMD值比較，差異有統計學意義(P<0.05)。CB/CMC組在各時間段BMD值均顯著高于煅燒骨組、Bio-oss骨組及空白組，術后第2、4及12周時高于Bio-oss/CMC組。見表1。

表1 各組家兔術后第2、4、8及12周時骨缺損部位的BMD值比較Tab.1 Comparison of BMD values at 2nd, 4th, 8th and 12th weeks after surgery in each group

2.4 Tb.Th

術后2、4、8及12周時，各組間的Tb.Th值比較，差異有統計學意義(P<0.05)。CB/CMC組在各時間點Tb.Th值均顯著高于煅燒骨組、Bio-oss骨和空白組(P<0.05)；術后第2、8、12周時也顯著高于Bio-oss/CMC組(P<0.05)；術后第4周CB/CMC組Tb.Th值與Bio-oss/CMC組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組家兔術后第2、4、8及12周時骨缺損部位的Tb.Th值比較Tab.2 Comparison of Tb.Th values at 2nd, 4th, 8th and 12th weeks after surgery in each group

2.5 Tb.Sp

術后第2、4、8及12周時各組Tb.Sp值比較，差異有統計學意義(P<0.05)。術后第2周CB/CMC組Tb.Sp值顯著低于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)，但與Bio-oss/CMC組、煅燒骨組、Bio-oss骨組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。術后第4周CB/CMC組Tb.Sp值顯著低于其他各組，術后8周及12周CB/CMC組Tb.Sp值顯著低于Bio-oss骨組和空白組，與Bio-oss/CMC組及煅燒骨組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組家兔術后2、4、8及12周時骨缺損部位的Tb.Sp值比較Tab.3 The differences of Tb.Sp values at 2nd, 4th, 8th and 12th weeks after surgery in each group

2.6 Tb.N

術后第2、4、8及12周時各組間的Tb.N值比較，差異有統計學意義(P<0.05)。術后第4、8、12周時CB/CMC組Tb.N值顯著高于其他各組，術后第2周CB/CMC組Tb.N值顯著高于煅燒骨、Bio-oss骨和空白組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；但與Bio-oss/CMC組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組家兔術后第2、4、8及12周時骨缺損部位的Tb.N值比較Tab.4 Comparison of Tb.N values at 2nd, 4th, 8th and 12th weeks after surgery in each group

3 討論

測定生物材料的成骨性能，在做動物體內實驗時，常選擇松質骨作為植入部位，同時要求骨缺損的大于或等于5 mm，以避免骨缺損在不填充骨移植材料的情況下即可自行愈合[13-15]。本實驗選擇家兔一側下頜骨體部作為植入區，制造直徑約為5 mm的骨缺損區，缺損區位于松質骨內，本實驗觀察期內空白組未見骨缺損自行愈合，證明缺損區大小合適。從各組取出后的實驗標本來看，CB/CMC復合材料相對于對照組在引導成骨方面更具優勢，CB/CMC復合材料組在12周時逐漸被新生骨組織所替代，但仍然維持支架結構穩定，未被完全吸收，保證骨組織能在其上順利生長，相較于其他組材料在引導骨組織生長方面更具優勢。組織工程研發出的三維混合支架材料是將一種或者多種骨移植材料與聚合物和/或生長因子復合，從而綜合各自材料性能上的優點來補足單一材料上的不足，以達到獲得理想的新生骨量與骨質量[16-17]。

Micro-CT相對于臨床CT能更快的采集到三維圖像，它一般使用錐形X線束(Cone Beam)，而臨床CT使用的為扇形X線束，采用錐形X線束能得到更高的分辨率，提高射線的利用率[18]。因此在骨組織工程的實驗研究中，Micro-CT因能更精確全面的測量骨結構，并且對研究骨組織達到無創效果，是一種近年來被廣泛采用的評價骨的質與量以及評測骨組織強度的新技術。Micro-CT革新了以往對于骨形態學的評價標準，通過直接測量骨結構厚度，檢測骨小梁變化，描述骨3D分布，得到直觀度遠高于傳統形態的計量學參數[19-21]。張亨國等[22]對植入動物體內種植體的周圍骨界面進行Micro-CT掃描，使用軟件分析得到一系列相關數據，通過這些分析數據能更為客觀的評價種植體與周圍骨組織的結合情況。Jae Min Song等[23]運用Micro-CT檢測CFB-HAP與Bio-Gide膜對大鼠骨缺損愈合的影響，證實Micro-CT能有效地分析及測量新骨的形成，并能得出量化的結果。在之后的研究中，例如研發制造各類高仿生以及個性化生物材料，或是將已制造出的材料與天然組織進行比較分析時，Micro-CT具有極高的指導性及使用價值，特別是在骨組織工程的研究中，Micro-CT為其研發設計提供了一種新的評價方法[24]。最為重要的是Micro-CT為骨組織工程實驗研究提供的一個關鍵優勢在于，骨組織再生實驗的結果可被量化[25]。Micro-CT檢測數據中Tb.N是指給定長度內骨組織與非骨組織的交點數量，骨質疏松時，Tb.N值減小。Tb.Sp是指骨小梁之間的髓腔平均寬度，Tb.Sp增加，提示骨吸收增加。在多孔材料中，Tb.Sp即可理解為孔隙率。Tb.Th是指骨小梁的平均厚度，骨質疏松時，Tb.Th 值減小。在多孔材料中，Tb.Th 也可理解為孔壁厚度。通過檢測分析這些數據以了解骨移植材料在植入動物體內后影響骨質生成的具體情況。

本次實驗，將Micro-CT掃描得出的數據進行統計學分析可以看出，各組BMD值均隨時間的延長而遞增，證明各組缺損區內骨質隨時間的增加均有所增長，而植入材料的4組的BMD值在各時期均顯著高于空白組，證明在缺損區內植入骨移植材料后的骨愈合程度顯著強于自然愈合。CB/CMC復合材料組的BMD值在各時間段均顯著高于其它各組(P<0.05)，證明CB/CMC復合材料組在單位體積內生成的骨質量顯著多于其它各組。各組Tb.N值均隨時間延長而遞增，植入材料的4組的Tb.N值在各時期均高于空白組，證明各組缺損區內的骨小梁數量均隨時間的增加而有所增加，且缺損區在植入骨移植材料后的骨小梁生成量顯著多于自然愈合。CB/CMC復合材料組的Tb.N值在各時間段顯著高于其它各組(P<0.05)，證明CB/CMC復合材料在植入后，在單位長度內生成的骨小梁數量均顯著多于其它各組，有比對照組所植入材料更強的骨生成能力。各組Tb.Sp值均隨時間延長而遞減，植入材料的4組的Tb.Sp值在各時期均低于空白組，術后4、8、12周時，CB/CMC復合材料組的Tb.Sp值顯著低于Bio-oss骨組(P<0.05)，證明CB/CMC復合材料相較于Bio-oss骨在植入缺損區后，在單位體積內形成的骨小梁密度更高。各組Tb.Th值均隨時間延長而遞增，植入材料的4組的Tb.N值在各時期均高于空白組，證明各組缺損區內的骨小梁厚度均隨時間的增加而有所增加，且缺損區在植入骨移植材料后所生成的骨小梁厚度顯著高于自然愈合。CB/CMC復合材料組在各時間段的Tb.Th值均顯著高于其他各組(P<0.05)，證明缺損區植入CB/CMC復合材料后所生成骨小梁的平均厚度顯著高于其它各組。

綜上所述，CB/CMC復合材料植入缺損區后，通過其良好的孔隙率及骨引導、骨誘導作用，在相同的時間內能生成多于對照組的骨質，且所生成骨質在骨小梁數目、間隙、厚度方面均優于對照組，能更好地完成其作為骨移植材料的作用，修復骨缺損，完成骨重建，是一種理想的，且具有良好生物相容性、骨引導及骨誘導作用的骨移植材料。