mTOR非依賴途徑介導二甲雙胍對類風濕關節炎大鼠心血管損傷的作用及機制*

李培霆， 劉俊， 周海燕， 李龍*， 曾家順*

(貴州醫科大學附屬醫院 風濕免疫科， 貴州 貴陽 550004)

類風濕關節炎(rheumatoid rthritis，RA)是一種常見的以關節受累為主的慢性全身性自身免疫病，除關節外，肺、心、神經系統等組織或器官也可受累，有較高的致殘及致死率[1]。近年來，RA患者體內自身免疫介導的炎癥會進一步導致血管內皮功能紊亂、氧化應激及高凝高血脂狀態，直接或間接參與心血管疾病發生和發展，導致了動脈粥樣硬化的發生和血管內皮功能障礙[2]；除此之外，糖皮質激素、非甾體抗炎藥等治療手段可增加動脈粥樣硬化的風險[3]。因此，RA患者合并心血管損傷的發病率及死亡率較正常人明顯增高[4]。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K/Akt )信號途徑分為依賴性和非依賴性，主要以哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)為交點[5]。在PI3K/Akt非依賴性途徑中，發現激活狀態的磷酸腺苷活化蛋白激酶(5′-adenosine monosphosphate-activated protein kinase，AMPK)信號通路，可抑制血管內皮細胞增殖及代謝，并促進血管內皮細胞凋亡[6]。二甲雙胍(metformin，Met)在糖尿病及其并發癥的作用研究較多[7]，但在RA中心血管損傷的調節研究較少，本實驗通過對RA大鼠模型進行Met干預，觀察其靶向AMPK信號通路對心血管損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物來源 清潔級健康雄性Wistar大鼠32只(購自本校動物實驗中心)，體質量190～220 g，適應性飼養7 d。

1.1.2主要試劑及儀器 牛Ⅱ型膠原(10 mg/支，美國Chondrex公司)，弗氏不完全佐劑(5 mL/支，美國Sigma公司)，AMPK抑制劑Compound C(美國sigma公司)，0.1 mol/L冰乙酸(上海申博化工有限公司)，4%水合氯醛(天津福晨化學試劑廠)，Met(中美上海施貴寶制藥有限公司)，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和mTOR抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，AMPK(武漢三鷹生物有限公司)；炎癥因子檢測試劑盒和C6流式細胞儀(美國BD公司)，5424R離心機(美國Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1造模及分組 取8只大鼠作為正常對照組(Con組，生理鹽水灌胃)，其余24只大鼠造模：將牛Ⅱ型膠原溶于0.1 mol/L冰醋酸中，制成質量濃度為 2 g/L溶液，與等量弗氏完全佐劑混合成穩定乳劑(0.1 g/L)注射于大鼠尾根部0.2 mL，第14天相同方法加強免疫；每隔3～5 d測量足背厚度及評估關節炎指數評分，其中關節炎指數評分定義如下[8]：踝關節正常為0分，踝關節出現紅斑和輕微腫脹為1分，踝關節到跖趾關節或掌關節出現紅斑或中度腫脹為3分，踝關節到趾關節出現紅斑和重度腫脹為4分，四肢評分累計0～16分；大鼠出現2次反應且關節炎指數大于5分即造模成功。24只模型鼠隨機均分為模型組(RA組，生理鹽水灌胃)、Met治療組[Met組，400 mg/(kg·d) Met灌胃]、聯合治療組[Met+CC組，400 mg/(kg·d) Met灌胃+AMPK抑制劑Compound C 20 mg/(kg·d)腹腔注射]，造模后第21天起開始干預，用生理鹽水將鹽酸Met充分溶解并搖勻，制成藥水后分別對Met組、Met+CC組治療5周，同時Met+CC組大鼠予以Compound C 20 mg/(kg·d)腹腔注射，總實驗觀察周期為8周。實驗結束時，稱重后麻醉各組大鼠，經腹主動脈采血，然后暴露大鼠胸腔，剪去兩側大部分肋骨及胸骨，取心臟及胸主動脈后予福爾馬林固定，4%甲醛浸泡，制成組織切片，顯微鏡觀察組織病理學變化。

1.2.2心臟及血管組織學觀察 取同一部位心臟及血管組織，4%甲醛浸泡，病理切片、HE染色，光鏡下觀察心臟及血管組織學形態，并用IPWin32系統采集圖像，由病理科醫師對結果評估及分析。

1.2.3血清炎癥因子γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)及IL-17含量檢測 實驗結束時分別取各組大鼠全血2 mL，3 000 r/min離心15 min，取上清置于Ep管，按炎癥因子檢測試劑盒說明書操作程序，采用流式細胞儀檢測各組大鼠血清IFN-γ、IL-6及IL-17的熒光強度。

1.2.4心臟及血管組織VEGF、mTOR及AMPK蛋白表達 采用PV-6000試劑盒檢測組織抗原表達，包埋切片、脫蠟、水化、切片后孵育一抗(VEGF、AMPK及mTOR)及二抗(山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體)37 ℃孵育30 min，PBS沖洗；染色液顯色至棕黃色終止反應，經光學顯微鏡觀察陽性染色的強度，并用Image-pro Plus Version6.0 采集圖像。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 大鼠一般狀況

Con組大鼠精神狀態可，毛發有光澤，行動自如。RA組大鼠逐漸關節紅腫，進食、活動減少，精神萎靡，后期出現行走跛行、關節畸形。見圖1。

圖1 Con組與RA組大鼠不同時間前足的肉眼觀Fig.1 Observation of forefoot in Con group and RA group in different time

2.2 心臟及血管組織學變化

Con組大鼠見心臟及血管的組織結構；RA組與Met+CC組大鼠病變相近，心肌細胞出現不同程度的變性、壞死，可見局灶性或彌漫性的炎性細胞浸潤，血管內膜層呈現一定的腫脹并伴纖維排列紊亂，中層有不同程度變性如彈力組織網斷裂、平滑肌玻璃樣變性，外膜纖維化；Met組大鼠病變程度較RA組有所減輕。見圖2。

圖2 各組大鼠心臟及血管組織學變化(HE，×400)Fig.2 Results of cardiovascular tissues in each group(HE，×400)

2.3 血清INF-γ、IL-6及IL-17水平

RA組大鼠血清INF-γ、IL-6及IL-17水平高于Con組，差異有統計學意義(P<0.05)；Met組大鼠血清INF-γ、IL-6水平低于RA組和Met+CC組，差異有統計學意義(P<0.05)；采用AMPK抑制劑后，Met+CC組大鼠INF-γ、IL-6及IL-17含量與RA組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠的血清INF-γ、IL-6及IL-17水平Tab.1 Results of serum INF-γ,IL-6 and

2.4 心血管組織VEGF、AMPKa及mTOR的表達

與Con組比較，RA組大鼠心血管組織VEGF、mTOR表達水平升高，AMPK水平下降，差異有統計學意義(P<0.05)；與RA組、Met+CC組比較，Met組大鼠心血管組織VEGF水平降低，AMPK、mTOR升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；Met+CC 組與RA組比較差異無統計學意義(P>0.05)，提示上述變化受到AMPK抑制劑的拮抗。見表2和圖3。

圖3 各組大鼠心血管組織VEGF、AMPK及mTOR蛋白的表達(400×)Fig.3 Expression of VEGF,AMPK and mTOR protein in vascular tissue of rats in each group(400×)

表2 各組大鼠心血管組織通路相關蛋白的光密度值Tab.2 Optical density of cardiovascular tissue pathway related proteins in each

3 討論

近年來，大量研究證實炎癥因子微調控可以加速心血管損傷的進程[9]。本研究發現，RA組大鼠心血管組織HE染色中心肌細胞變性壞死、炎性細胞浸潤及血管病變的程度多于Con組，血清炎癥因

子INF-γ、IL-6及IL-17也較Con組升高(P<0.05)，提示RA處于持續炎癥狀態的同時存在早期心血管損傷。Met治療后大鼠血清炎癥因子INF-γ、IL-6降低表達減少(P<0.05)，提示Met可以減輕RA大鼠炎癥反應。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是炎癥存在的一種形式，有文獻報道，腹腔注射LPS可引起大鼠心臟功能障礙和心臟毒性，其機制包括AMPK/mTOR激活介導的抑制自噬作用，AMPK的激活改善LPS誘導的大鼠心臟毒性及心肌自噬上調[10]。本研究結果顯示RA組大鼠VEGF表達也較Con組升高，Met治療后表達降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，提示Met可以降低RA心血管組織VEGF表達。VEGF是內皮增殖、遷移的刺激劑，能直接促進心肌血管的新生，增加血管通透性作用[11]。有研究表明，Met可以通過抑制人內皮細胞增殖、遷移，從而達到抑制血管新生的作用[12]；Met作用于人臍靜脈內皮細胞可抑制INF和IL-6[13]；Met在糖尿病合并心血管疾病中有明顯的保護作用，其機制并非是控制血糖，而是降低炎癥因子和抗氧化的作用[14-15]；在人冠狀動脈粥樣斑塊標本中VEGF呈高度表達，影響斑塊的穩定性，且新生血管形成可促進粥樣斑塊的病變及范圍擴大[16]，因此Met可以抑制VEGF水平更有利于延緩斑塊。本實驗中，與Con組相比，RA組與Met+CC大鼠心血管組織AMPK表達降低(P<0.05)，通過Met治療后AMPK蛋白、mTOR表達增加(P<0.05)，說明Met可以調控AMPK及mTOR表達，而Compound C抑制了這些作用(P<0.05)，提示AMPK通路可能參與這一過程。mTOR信號通路包括Akt/mTOR和AMPK/mTOR通路，AMPK是一種能量平衡的代謝傳感器，細胞能量的增加和AMP/ATP比值的增加能促進AMPK的形成[17]。它通過磷酸化抑制mTOR進而誘導自噬[18-19]，AMPK活化能下調mTOR活性將細胞周期阻滯于G0/G1期，抑制細胞生長、增殖[20-21]。以往的研究證實Met是一種有效的AMPK激活劑，主要通過激活AMPK下調哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1(mammalian target of rapamycin complex1，mTORCl)表達，改變下游VEGF、Caspase3等水平，產生多種有益的效應[22]；Schneider等[23]證實了AMPK可以通過激活內質網鈣泵和大量導鈣通道來舒張阻力血管。可見，AMPK的激活在血管平滑肌亦可以產生保護血管的作用。然而，本實驗中RA組大鼠存在AMPK激活時，mTOR磷酸化水平也隨之升高，與AMPK/mTOR調控通路的機制存在矛盾，推測AMPK激活時，可能還受到依賴途徑PI3K/Akt等其他信號調控mTOR表達。

綜上所述，Met對RA早期心血管損傷有保護作用，可通過減輕RA炎癥反應及提高AMPK水平進而調節VEGF表達，從而延緩RA心血管損傷的進展，且Met還可能通過其他途徑影響mTOR表達。