羊耳菊活性部位對PXR高表達HepG2細胞中CYP3A4蛋白表達的影響*

楊暢， 宋菲， 何俊奇， 王永林， 李勇軍， 蘭燕宇， 陳一飛， 劉亭**

(1.貴州醫科大學 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室 & 貴州省藥物制劑重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學 民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽 550004； 3.上海藥品評審核查中心， 上海 201203)

細胞色素P450酶屬于血紅素-硫醇鹽蛋白的超基因家族，可介導臨床約90%的藥物代謝[1-2]，其活性及表達量的變化直接影響其底物在體內的生物轉換[3-4]，是許多藥物發生療效改變、毒性反應及藥物間相互作用的原因之一[5-6]。細胞色素P450 3A4酶(cytochrome P450 3A4 enzyme，CYP3A4)作為細胞色素P450酶家族中重要成員，在臨床前研究中檢測藥物對CYP3A4的誘導或抑制作用，已成為必不可少的一個環節[7]。羊耳菊[Inulacappa(Buch.-Ham. ex D. Don)DC.]又名山白芷、白牛膽和見消腫等，為菊科旋覆花屬植物羊耳菊的全草或根，具有消腫止痛、祛風解熱的功效，常用于感冒發熱、風濕疼痛、癰瘡疔毒、咽喉腫痛及乳癰等癥[8]。本課題組前期對羊耳菊藥材進行了較為系統的研究，篩選出了羊耳菊藥材發揮療效作用的活性部位[9-12]。目前以羊耳菊活性部位(main active constituents fromInulacappa, IC-MAC)為主要成份的藥物有鼻康片、雙羊喉痹通顆粒、菊黃上清含片、蓮菊感冒膠囊等制劑，臨床上應用廣泛[13-15]，課題組前期研究還發現IC-MAC可下調CYP3A4的比活性[16]，但機制尚不清楚。本文通過構建可高表達CYP3A4轉錄調節因子——孕烷X受體(pregnane X receptor, PXR)的人肝癌HepG2細胞系，研究IC-MAC對PXR的基因轉錄調節活性的影響，探討IC-MAC下調CYP3A4活性的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株和細菌 人肝癌HepG2細胞株(江西阿普斯戴爾生物科技有限公司)，DH5α感受態大腸桿菌(北京博邁德基因技術有限公司)，質粒pcDNA3.1-PXR由浙江大學藥學院陳樞青教授惠贈。

1.1.2主要試劑 IC-MAC(自制[16])，G-418遺傳霉素硫酸鹽、氨芐西林及溶菌肉湯(luria-bertani，LB)液體培養基(北京索萊寶科技有限公司)，質粒提取試劑盒(杭州愛思進生物技術有限公司)，FuGENE?6 轉染試劑(北京普洛麥格生物技術有限公司)，4S Red Plus 核酸染色試劑盒(上海BBI生命科學有限公司)，改良杜氏伊格爾培養基(dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)培養基、胎牛血清、辣根過氧化氫酶標記的山羊抗兔及山羊抗小鼠(美國Thermo公司)，兔抗PXR，重組PXR蛋白和小鼠抗重組人β-肌動蛋白(recombinant human beta-actin，β-actin；英國Abcam公司)。

1.1.3主要儀器 EL304型電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，二氧化碳恒溫培養箱(美國Thermo公司)，TS100型倒置顯微鏡(日本Nikon公司)，數顯立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業有限公司醫療儀器廠)，PowerPacBasic型電泳儀、Trans-Blot Turbo型蛋白快速轉印儀及GBOXChemiXL1.4型凝膠成像系統(美國Bio-rad公司)，ZDP-150型恒溫振蕩培養箱(上海精宏實驗設備有限公司)，SNAP i.d.2.0 MultiBlot Frame快速孵育儀(美國Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1質粒pcDNA3.1-PXR擴增及提取 將質粒pcDNA3.1-PXR轉化至DH5α感受態大腸桿菌中，并接種于含50 mg/L氨芐西林的LB液體培養基中培養13 h，根據Axygen質粒提取試劑盒的說明書對質粒進行提取，質粒圖譜如圖1所示。

圖1 pcDNA3.1-PXR質粒圖譜Fig.1 Map of pcDNA3.1-PXR plasmid

1.2.2細胞培養 人肝癌細胞HepG2用含10%胎牛血清的DMEM培養基，37 ℃的5%CO2培養箱中培養，當細胞匯合至80%左右時進行傳代。

1.2.3高表達PXR-HepG2細胞模型的構建 HepG2細胞以每孔1.5×105個的細胞密度接種于24孔板培養24 h，待細胞長至70%，將FuGENE 6轉染試劑與pcDNA3.1-PXR質粒按2 ∶1的體積質量比轉染進HepG2細胞，轉染24 h后加含800 mg/L G418的DMEM完全培養基進行篩選培養，以重組PXR(n=1)為對照，利用Western blot檢測PXR-HepG2和HepG2細胞(n=2)中 PXR的表達水平，篩選得到高表達PXR-HepG2細胞。

1.2.4IC-MAC處理PXR-HepG2和HepG2細胞 IC-MAC用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)配成母液1 000×(25、50及100 g/L)，-20 ℃避光保存，加藥時用預熱至37℃的完全DMEM培養基稀釋至1×(25、50及100 mg/L)。將細胞分為陰性對照組(DMSO組，0.1%)、藥物處理組(25、50及100 mg/L IC-MAC)和陽性藥物組[PXR激動劑利福平(rifampin，RIF；10 μmol/L)]，分別處理24、48及72 h后，提取各組細胞總蛋白備用。

1.2.5PXR和CYP3A4蛋白表達 采用Western blot檢測，制備10%的SDS-PAGE凝膠電泳的分離膠，在樣品孔中依次加入1.2.3項下或1.2.4項下各組蛋白樣品和蛋白Marker，80 V電泳20 min后再繼續以120 V電泳60 min。電泳結束后利用半干轉儀器將蛋白轉移至已活化的PVDF膜上，并用SNAP快速轉膜儀進行封閉和抗體孵育。BSA封閉30 min，一抗孵育(CYP3A4一抗孵育20 min，PXR一抗孵育30 min)，TBST洗滌3 min，洗滌完畢后加二抗孵育10 min；TBST洗滌3 min，于PVDF膜上加發光液1 mL，室溫反應1 min后用凝膠成像儀器拍照。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 高表達PXR的PXR-HepG2細胞模型構建

作為陽性對照，重組PXR蛋白出現單一條帶，說明所用抗體能正確識別PXR蛋白；PXR-HepG2細胞中的PXR蛋白表達明顯高于HepG2細胞，且差異有統計學意義(P<0.01)，提示高表達PXR的PXR-HepG2細胞模型構建成功。見圖2。

注：A為PXR蛋白電泳條帶，B為PXR蛋白相對表達量；(1)與HepG2組比較，P<0.01。圖2 PXR-HepG2和HepG2細胞中PXR的蛋白表達Fig.2 PXR protein expression in PXR-HepG2 and HepG2 cells

2.2 IC-MAC對PXR-HepG2細胞中CYP3A4蛋白表達的影響

作為陽性藥物，RIF在PXR-HepG2細胞和HepG2細胞中均能上調CYP3A4的表達，提示PXR-HepG2和HepG2細胞對PXR激動劑敏感。25、50及100 mg/L IC-MAC分別干預PXR-HepG2和HepG2細胞24、48及72 h后，2種細胞中CYP3A4蛋白表達水平均較DMSO組上調，且24 h時PXR-HepG2組的上調倍數高于HepG2細胞，差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖3。

注：A、B分別為IC-MAC處理后PXR-HepG2和HepG2細胞中CYP3A4蛋白電泳條帶，C、D分別為IC-MAC處理后PXR-HepG2和HepG2細胞中CYP3A4蛋白相對表達量；與DMSO組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖3 IC-MAC處理后PXR-HepG2和HepG2細胞中CYP3A4的蛋白表達Fig.3 CYP3A4 protein expression in PXR-HepG2 and HepG2 cells after treatment with IC-MAC

3 討論

PXR是核受體超家族的成員，具有調節基因表達的功能[17-18]。當PXR與配體結合后，構象發生改變，與視黃醛X受體形成異二聚體，同時招募輔活化因子或輔阻遏物形成復合物，然后結合到靶基因啟動子上的順式作用元件，調節靶基因的轉錄[19]。自2000年Moore等[20]發現圣約翰草能激活PXR、誘導CYP3A4的表達后，PXR逐漸成為研究P450酶表達調控的熱點靶蛋白。PXR調控的基因非常廣泛，包括Ⅰ相代謝酶、Ⅱ相代謝酶和轉運蛋白等[17-18]。研究表明，PXR是CYP3A4的主要轉錄調控因子[21-22]。

HepG2是一種永生化人肝癌細胞系，目前作為常用的體外細胞模型被廣泛用于CYP3A4的相關研究實驗中[23-24]。HepG2細胞雖具有較完整的Ⅰ相代謝酶表達，但PXR和CYP3A4的表達水平不高，通過瞬時轉染實現外源性PXR的高表達可以達到考察PXR功能的目的[25]。因此，本文選用HepG2細胞作為PXR高表達的體外轉基因模型的載體，考察IC-MAC是否通過PXR途徑來調節CYP3A4的表達。實驗結果顯示，構建的PXR-HepG2細胞模型能高表達PXR，且PXR激動劑RIF能誘導CYP3A4的表達，表明體外細胞模型構建成功。

在此基礎上，本研究分別用不同濃度的IC-MAC處理PXR-HepG2細胞和HepG2細胞，與陰性對照組相比，IC-MAC均能誘導2種細胞中CYP3A4的表達；經IC-MAC處理24 h后，相較于48和72 h，PXR-HepG2細胞中CYP3A4表達上調幅度最高；在瞬時轉染的條件下，外源基因的表達會隨著時間的推移逐漸降低；在24 h時，PXR-HepG2細胞中PXR的表達量可能達到最高值，然后逐漸下降，其對CYP3A4的轉錄調節能力也隨之變化。所以IC-MAC處理后，PXR-HepG2細胞中CYP3A4表達水平在24 h的上調幅度最大。在24 h時，與HepG2細胞相比，PXR-HepG2細胞中CYP3A4表達水平上調幅度明顯更大，說明IC-MAC可能通過PXR來上調CYP3A4的表達。

課題組前期曾利用Cocktail 探針藥物法考察IC-MAC對大鼠細胞色素P450 主要亞型酶(CYP3A4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP2E1)比活性的影響，結果發現IC-MAC可抑制CYP3A4的比活性[16]，但是本研究卻發現IC-MAC可通激活PXR促進CYP3A4的表達。影響酶比活性的途徑通常有2種，一是改變酶活性，二是通過改變酶的表達來增加或減少單位蛋白內的酶含量[26]。本文研究IC-MAC對PXR的基因轉錄調節活性的影響，主要是從酶表達調控的角度來研究IC-MAC下調CYP3A4活性的機制。因此，PXR被激活后，首先是上調CYP3A4 mRNA表達，進而增加其蛋白表達。有研究表明，蛋白翻譯后修飾可能會導致P450酶mRNA，蛋白表達和活性不一致的現象[27]。因此，可推測IC-MAC 對CYP3A4表達及活性的影響是一個復雜的過程，可能涉及到蛋白翻譯后修飾。在下一步的研究中，將從導致蛋白降解的泛素化修飾入手，以期解釋IC-MAC處理后CYP3A4表達和活性不一致的問題。