CYP450蛋白在HepG2細胞與小鼠原代肝細胞中的表達差異*

李靖， 彭仕林， 劉亭， 李勇軍， 王永林， 王愛民**

(1.貴州醫(yī)科大學 貴州省藥物制劑重點實驗室 & 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學 藥學院， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州醫(yī)科大學 民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽 550004)

細胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)主要分布在肝臟中，參與絕大多數(shù)藥物的Ⅰ相代謝，在藥物代謝過程中具有重要意義[1-4]。肝臟藥物代謝研究是藥物開發(fā)中不可缺少的一個環(huán)節(jié)，但是由于體內(nèi)研究的復雜性，研究人員往往選擇體外肝細胞模型開展藥物代謝機制研究[5-6]。目前采用的細胞模型主要有小鼠原代肝細胞、肝細胞系等。小鼠原代肝細胞來源于小鼠肝組織，其肝臟藥物代謝酶的表達情況最接近于機體，被廣泛應用于藥物代謝途徑、代謝效率、藥物代謝酶的抑制和誘導等方面的研究[7-8]。HepG2細胞來源于肝細胞，是一種表型與肝細胞極為相似的肝胚胎瘤細胞株，保留了肝細胞的許多生物學特性[9-10]。細胞模型的選擇在體外代謝實驗中及其重要，且細胞中CYP450表達豐度直接影響到相關(guān)研究的科學性，故本研究旨在分析HepG2細胞和小鼠原代肝細胞中CYP450蛋白表達的差異，為合理選擇CYP450代謝模型提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及細胞 6只SPF級昆明種雄性小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK (黔) 2012-0001。飼養(yǎng)于濕度40%～70%，溫度20～25 ℃的環(huán)境中，實驗前適應性飼養(yǎng)7 d。HepG2細胞購于上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.1.2藥品與試劑 BCA蛋白濃度測定試劑盒(索萊寶生物科技有限公司)、Percoll(索萊寶生物科技有限公司)、CYP3A4抗體(Abcam公司)、CYP1A2抗體(Abcam公司)、CYP2D6抗體(CST公司)、CYP2C19抗體(Abcam公司)、CYP2E1抗體(Abcam公司)、CYP2C9抗體[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]、β-actin抗體(Abcam公司)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔Ig G(Invitrogen公司)、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠Ig G(Invitrogen公司)。

1.1.3儀器 DH6000BII型電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特儀器有限公司)、TS-100F熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)、Thermo fresco 17低溫高速離心機(美國Thermo公司)、電泳儀(美國伯樂生物公司)、蛋白快速轉(zhuǎn)印儀(美國伯樂生物公司)、凝膠成像系統(tǒng)(基因有限公司)。

1.2 方法

1.2.1分離小鼠原代肝細胞 采用改良的兩步灌流法分離小鼠原代肝細胞[11-13]：取禁食12 h后的SPF級昆明種小鼠，用10%水合氯醛麻醉；暴露肝臟，用平口鑷將腹部臟器向右外側(cè)牽拉，暴露并識別肝門靜脈與下腔靜脈；用留置針刺穿肝門靜脈，使用37 ℃溫浴的前灌流液進行第一次灌注，灌注體積為24 mL/只，灌流液從肝門靜脈進入、從下腔靜脈流出；肝臟完全變?yōu)橥咙S色后，隨即換成已溫浴至37 ℃且含有Ⅳ型膠原酶的后灌流液進行灌注，灌注體積為40 mL/只，灌流方向同第一次灌注。用手術(shù)剪剪下肝臟，使用無血清培養(yǎng)基清洗2次；在新的無血清培養(yǎng)基中使用細胞刮刀碾碎肝臟，即得肝組織懸液；使用200目篩網(wǎng)過濾肝組織懸液，取濾液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管，533 r/min離心3 min，棄上清，加入新的無血清培養(yǎng)基混勻離心，重復3次；取沉淀，按照Percoll細胞分離液說明書，加入適量無血清培養(yǎng)基、10×PBS與Percoll細胞分離液后，混勻、1 012 r/min離心7 min，棄上清，即得小鼠原代肝細胞。

1.2.2小鼠原代肝細胞培養(yǎng) 向獲得的小鼠原代肝細胞沉淀中加入DMEM培養(yǎng)基10 mL(含10%FBS，1%青霉素-鏈霉素)重懸、混勻，按密度4.5×108個/L接種于預包被有鼠尾膠原的細胞培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基體積為5 mL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至完全貼壁后，吸去舊培養(yǎng)基，加入1×PBS 2 mL洗滌；再加入新的DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS，1%青霉素-鏈霉素)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察細胞生長形態(tài)。

1.2.3HepG2細胞的培養(yǎng) HepG2細胞用DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS，1%青霉素-鏈霉素)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4蛋白提取 小鼠原代細胞培養(yǎng)36 h、HepG2細胞長至對數(shù)生長期時，棄培養(yǎng)基并加入1×PBS 2 mL洗滌2次。按400 μL/個培養(yǎng)瓶加入RIPA裂解液(含1 mmol/L PMSF)，在冰上搖晃至細胞全部脫落，收集細胞懸液至1.5 mL離心管中，渦混10 s后置于冰上裂解5～10 min，重復3～5次，4 ℃、12 000 r/min離心10 min；收集上清液；用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。

1.2.5Western blot檢測CYP450蛋白表達 取12 μg總蛋白，用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離，使用半干轉(zhuǎn)系統(tǒng)25 V、1.0 A轉(zhuǎn)膜30 min，轉(zhuǎn)膜后用5% BSA于4 ℃封閉4 h。按β-actin抗體1 ∶5 000、CYP2E1抗體1 ∶5 000、CYP2D6抗體1 ∶1 000、CYP2C9抗體1 ∶500、CYP2C19抗體1 ∶2 000、CYP3A4抗體1 ∶2 000、CYP1A2抗體1 ∶2 000的比例，于4 ℃孵育12 h；用1×TBST洗膜5次后，加入相應的二抗(1 ∶2 000)，于4 ℃下孵育1.5 h；1×TBST洗膜5次后，加入ECL Plus化學發(fā)光顯影液顯影，使用Quantity one軟件進行條帶灰度值分析，計算目的蛋白/內(nèi)參蛋白的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠原代肝細胞形態(tài)

分離小鼠原代肝細胞后，分別于4、6及24 h在倒置顯微鏡下觀察形態(tài)，如圖1所示，細胞生長至4 h時，呈圓形；細胞生長至6 h時，呈圓形，較多細胞可見雙核；當細胞生長至24 h時，細胞具有典型的肝細胞形態(tài)，可見雙核，呈多邊形，且細胞相互接觸，排列成肝索樣結(jié)構(gòu)。

4 h 6 h 24 h圖1 小鼠原代肝細胞形態(tài) (100×)Fig.1 Morphology of mouse primary hepatocytes (100×)

2.2 CYP2E1及CYP2C19蛋白表達

HepG2細胞中未檢測到CYP2E1及CYP2C19蛋白表達；小鼠原代肝細胞中CYP2E1/β-actin為1.238±0.045、CYP2C19/β-actin為1.262±0.195，CYP2E1及CYP2C19蛋白表達明顯高于HepG2細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖2。

注：(1)與HepG2細胞比較，P<0.01。圖2 HepG2細胞與小鼠原代肝細胞中CYP2E1及CYP2C19蛋白表達Fig.2 The protein expression levels of CYP2E1 and CYP2C19 in HepG2 cells and mouse primary hepatocytes

2.3 CYP2C9及CYP2D6蛋白表達

如圖3所示，小鼠原代肝細胞中CYP2C9/β-actin為1.209±0.022，CYP2D6/β-actin為2.162±0.138；而HepG2細胞中CYP2C9/β-actin、CYP2D6/β-actin分別為0.154±0.029、0.781±0.077。小鼠原代肝細胞中CYP2C9的表達量約為HepG2細胞的7.9倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；小鼠原代肝細胞中CYP2D6的表達量約為HepG2細胞的2.8倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

注：(1)與HepG2細胞比較，P<0.01。圖3 HepG2細胞與小鼠原代肝細胞中CYP2C9及CYP2D6蛋白表達Fig.3 The protein expression levels of CYP2C9 and CYP2D6 in HepG2 cells and mouse primary hepatocytes

2.4 CYP3A4及CYP1A2蛋白表達

小鼠原代肝細胞中CYP3A4/β-actin、CYP1A2/β-actin分別為1.382±0.092及1.088±0.070，HepG2細胞中CYP3A4/β-actin為0.077±0.018、CYP1A2/β-actin為0.101±0.007。小鼠原代肝細胞中CYP3A4的表達量約為HepG2細胞的17.9倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；小鼠原代肝細胞中CYP1A2的表達量約為HepG2細胞的10.7倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖4。

注：(1)與HepG2細胞比較，P<0.01。圖4 HepG2細胞與小鼠原代肝細胞中CYP3A4及CYP1A2蛋白表達Fig.4 The protein expression levels of CYP3A4 and CYP1A2 in HepG2 cells and mouse primary hepatocytes

3 討論

細胞模型具有操作簡便、易獲得、經(jīng)濟等優(yōu)點，在藥物的ADMET研究中得到廣泛應用[14]。動物原代肝細胞、人肝細胞、人肝癌細胞是目前使用較多的肝細胞模型[15-16]。評估藥物代謝和毒性的體外模型的黃金標準是新鮮分離的人原代肝細胞，但其價格昂貴且不易獲得[17-18]。因此動物原代肝細胞，尤其是小鼠原代肝細胞，逐漸成為藥物ADMET研究的首選。除了原代肝細胞，肝癌細胞系如HepG2由于其容易獲取，價格低廉，也是目前常用的藥物ADMET模型[19-22]。而CYP450酶在藥物代謝中發(fā)揮重要作用[1]，故本實驗研究HepG2細胞與小鼠原代肝細胞的CYP450蛋白表達差異。

本研究結(jié)果表明，在HepG2細胞中檢測不到CYP2E1、CYP2C19的蛋白表達，且其CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4、CYP1A2的表達也明顯較低。這一結(jié)果與其mRNA水平研究結(jié)果一致[23-24]。由此推測，當使用該細胞模型研究由CYP2E1、CYP2C19代謝的藥物時，其實驗結(jié)果可能會與實際情況有所偏差。若必須使用HepG2細胞研究由CYP2E1、CYP2C19代謝的藥物，則須先建立CYP2E1、CYP2C19穩(wěn)定表達HepG2細胞系再進行相應研究，以確保實驗結(jié)果的準確性。而小鼠原代肝細胞中，CYP2E1、CYP2C19、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4、CYP1A2都有較高表達，且CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4、CYP1A2的表達量遠高于HepG2細胞(P<0.01)?？芍苯佑糜谘芯拷?jīng)CYP2E1、CYP2C19、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4、CYP1A2代謝的相關(guān)藥物。則當使用HepG2細胞與小鼠原代肝細胞對同一種藥物進行代謝或毒性研究時，小鼠原代肝細胞和HepG2細胞可能表現(xiàn)截然不同，藥物的毒性或藥效可能會被誤判。這提醒研究人員應根據(jù)實驗對象的特點，如是否需要CYP450激活，來合理選擇細胞模型。

綜上所述，本實驗成功研究了CYP450蛋白在HepG2細胞與小鼠原代肝細胞的表達差異，小鼠原代肝細胞具有較豐富的CYP450酶，可直接應用于藥物代謝和毒性評價研究[25]，而HepG2細胞CYP450蛋白表達水平較小鼠原代肝細胞低，影響其進一步應用于藥物代謝和毒性評價[26]，建議建立相應CYP450酶穩(wěn)定表達HepG2細胞系后再應用于此研究。