EBER原位雜交和免疫組化雙染中酶消化和抗原修復(fù)的優(yōu)化

何 嬌，羅陸僑，廖集琴

原位雜交和免疫組化雙染技術(shù)是在不同層次來(lái)檢測(cè)同一細(xì)胞上某些物質(zhì)的表達(dá)是否有相關(guān)性的一種實(shí)驗(yàn)方法。由于操作步驟復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)不易取得理想效果。我科結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況，經(jīng)過(guò)反復(fù)摸索，獲得滿意效果，現(xiàn)將我科經(jīng)驗(yàn)總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源收集廣東省人民醫(yī)院病理科2019年1～5月EBER陽(yáng)性病例16例，其中NK/T淋巴瘤 8例，Burkitt淋巴瘤2例，血管免疫母細(xì)胞性淋巴瘤4例，漿母細(xì)胞性淋巴瘤1例，淋巴結(jié)外周T細(xì)胞淋巴瘤1例。所有標(biāo)本均及時(shí)固定及規(guī)范化取材，經(jīng)10%中性福爾馬林固定。

1.2 試劑EBER原位雜交試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司，AP免疫組化試劑盒購(gòu)自徠卡公司，CD3、CD20一抗購(gòu)自上海基因公司。

1.3 方法

1.3.1預(yù)實(shí)驗(yàn)1 將組織連續(xù)4 μm厚切片4張，65 ℃烤片1 h，根據(jù)酶消化時(shí)間不同分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組(表1)，先進(jìn)行EBER原位雜交單染。

表1 預(yù)實(shí)驗(yàn)1方法及結(jié)果

1.3.2預(yù)實(shí)驗(yàn)2 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)1結(jié)果，選取胃酶消化12 min和16 min，再將實(shí)驗(yàn)分為8組(表2)，進(jìn)行第二步免疫組化染色。

表2 預(yù)實(shí)驗(yàn)2方法及結(jié)果

1.3.3原位雜交和免疫組化雙染 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)1和預(yù)實(shí)驗(yàn)2的染色結(jié)果，實(shí)驗(yàn)條件有所改進(jìn)：(1)切片脫蠟，無(wú)水乙醇洗3次，每次4 min，空氣中干燥切片。(2)滴加胃酶消化12 min，95%乙醇洗4 min，無(wú)水乙醇洗4 min，空氣中干燥切片。(3)滴加EBER探針，加蓋玻片，置于37 °C恒溫水浴箱中孵育3 h，揭開蓋玻片，PBS洗2次，每次4 min。(4)滴加地高辛二抗，室溫孵育30 min，PBS洗2次，每次4 min，DAB顯色5 min，PBS洗3 min。(5)免疫組化檢測(cè)在Leica Bond Ⅲ全自動(dòng)免疫組化儀上進(jìn)行，ER2修復(fù)12 min，PBS洗5 min×2。(6)一抗孵育55 min，PBS洗5 min×2。(7)Post primary AP孵育15 min，PBS洗5 min×2,Primary AP孵育15 min，PBS洗5 min×2。(8)快紅顯色10 min，蘇木精復(fù)染，干燥切片，中性樹膠封固。……