生物玻璃/聚乳酸多孔微球的制備及其作為細胞載體的研究

高龍, 張趙文斌, 常江

生物玻璃/聚乳酸多孔微球的制備及其作為細胞載體的研究

高龍1,2, 張趙文斌1,2, 常江1,2

(1. 中國科學院 上海硅酸鹽研究所, 上海 200050; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

具有大孔結構的多孔微球既可以在體外擴增細胞, 還可以作為細胞的傳輸工具, 通過注射的方式把細胞輸送到需要修復的組織部位。生物玻璃雖然生物活性良好, 但難以直接制備成大孔結構的微載體。因此, 本研究將生物玻璃(BG)與聚乳酸(PLA)高分子復合, 通過復乳法制備了一種含生物玻璃的多孔微球細胞微載體。并通過掃描電鏡(SEM)、熱重分析(TGA)、電感耦合等離子體發射光譜儀(ICP-OES)等方法研究分析了微球的形貌、組成和離子釋放。通過細胞實驗, 證明細胞可以在微球的多孔結構中粘附和增殖, 并且生物玻璃可以促進細胞增殖, 在組織工程中具有潛在應用。

多孔微球; 生物玻璃; 聚乳酸; 細胞微載體; 組織工程

多孔微球細胞微載體既可以在體外大量擴增細胞[1-2], 又可以作為細胞和藥物的載體, 通過注射的方法把細胞或藥物輸送到缺損部位[3-4]。特別是具有開放式大孔結構的微球, 既能夠在體外培養時幫助細胞向內生長, 又能在注射過程中起到支撐作用, 以保護微球內部的細胞免于擠壓和摩擦[5]。基于上述的優異性能, 微球細胞微載體已經用于骨缺損修復[6-9]、軟骨再生[10-11]和心肌修復[12]。但是, 多孔微球細胞微載體往往缺乏生物活性, 在體外細胞擴增或者體內細胞傳輸過程中, 材料本身沒有促進細胞增殖、遷移和分化的生物活性。通過添加生長因子等方式獲得生物活性, 往往也存在生長因子脆弱、容易失活和價格昂貴等弊端。所以, 在組織修復當中迫切需要一種具有良好生物活性的細胞微載體。

生物玻璃作為一種無機材料, 不僅在骨和牙齒的修復領域應用廣泛[13-15], 也被證實在軟組織修復中具有良好的生物活性[16]。但是, 生物玻璃難以直接制備成微球細胞微載體。首先, 生物玻璃難以塑型,制備出來的微球沒有細胞培養所需的大孔結構[17]; 其次, 純生物玻璃微球離子釋放速率過快, 其Si離子濃度甚至會超過60 μg/mL, 過高的離子濃度可對細胞增值有抑制作用, 比如會抑制成纖維細胞的遷移和分化[16]。此外, 生物玻璃快速的離子交換, 還會造成過強的堿性環境, 產生細胞毒性。目前, 常見的多孔微球細胞微載體往往是由高分子材料制備而成的, 雖然具有良好的生物相容性和孔結構, 但是, 缺乏刺激細胞增殖和分化的生物活性。因此, 將生物玻璃與高分子材料復合, 制備出一種既具有良好生物活性, 又具有多孔結構的微球細胞微載體, 對于組織缺損修復及組織工程應用具有重要意義。

因此, 本研究利用復乳法制備了一種生物玻璃/聚乳酸復合微球細胞微載體。首先, 生物玻璃能夠釋放活性離子, 促進細胞在微載體上的粘附和增殖, 并且由于離子的濃度比純生物玻璃微球低, 避免了離子濃度過高對細胞的抑制作用。其次, 聚乳酸具有良好的可塑性, 可以制備出貫通的多孔結構, 適宜細胞在其表面和內部的粘附和增殖。同時, 聚乳酸材料具有弱酸性, 生物玻璃呈堿性, 與聚乳酸復合可以避免聚乳酸降解產生的酸性對細胞產生不利影響。在本研究當中, 詳細探討了聚乳酸濃度和致孔劑用量對微球結構的影響。同時, 將復合微載體用于細胞的體外擴增, 考察了細胞在微球細胞微載體表面及內部孔結構上的粘附以及細胞的活力。

1 實驗方法

實驗所使用的聚乳酸(PLA), 分子量為100萬, 購于濟南岱罡生物工程有限公司。生物玻璃, 型號為45S5, 購于昆山華僑科技新材料有限公司。二氯甲烷、明膠和聚乙烯醇(PVA)統一購置于國藥集團化學試劑有限公司。

1.1 BG/PLA微球的制備

BG/PLA微球的制備過程如圖1所示:

首先, 將一定量PLA加入到20 mL二氯甲烷中, 充分溶解后, 加入0.2 g生物玻璃和一定量的致孔劑(6.5%的明膠水溶液)。利用高速剪切乳化機, 在15000 r/min的條件下, 將上述混合液快速乳化, 得到乳液備用。

然后, 將上述乳液加入到50 mL預冷至2 ℃的0.1% PVA溶液中。在800 r/min的速率下磁力攪拌2 min, 將乳液分散成小球。

最后, 將上述小球收集在800 mL預冷至2 ℃的0.1% PVA溶液中, 通風櫥內揮發去除溶劑。并用大量50 ℃的清水洗去明膠, 獲得多孔微球。

1.2 表征分析

將制備好的微球樣品冷凍干燥好, 置于導電膠上, 噴金后, 用掃描電子顯微鏡(JEM-2100F)觀察其形貌。通過熱重分析儀(TA-Q500), 分析復合微球中的生物玻璃含量, 升溫速率為10 ℃/min, 最高溫度是700 ℃, 氣氛條件是氮氣氣氛。Si離子釋放的測試方法: 將制備的1.0 g復合微球置于5 mL去離子水中, 在固定的時間點抽取上清液, 然后利用電感耦合等離子體發射光譜儀(ICP-OES)獲得浸提液中Si離子的濃度。

1.3 細胞的增殖

本實驗所用細胞為人骨髓間充質干細胞(hBMSCs, Cyagen Biosciences)。在37 ℃恒溫培養箱, 5vol% CO2的濕潤環境中培養, 每3 d換一次培養液。

圖1 生物玻璃/聚乳酸復合微球細胞微載體制備示意圖

細胞在微球上接種方法如下。100 mL培養皿中, 將5×106個細胞與1 mL微球進行混合。然后, 加入10 mL培養基, 在培養箱中以75 r/min轉速振搖 6 h。最后, 加入20 mL培養液轉移至37 ℃、5vol% CO2培養箱內長期培養, 兩天更換一次培養液。到達預設時間1、3和7 d時, 采用Cell Counting Kit-8 (CCK8, Japan)試劑盒檢測細胞活性。用Live-dead考察微球上的細胞分布以及生存和死亡情況。

2 結果與討論

2.1 BG/PLA微球的制備

粒徑是評價微球細胞微載體的一個重要指標。粒徑過小, 不利于細胞的粘附; 粒徑過大, 不利于注射。研究表明, 直徑約200 μm的微球細胞微載體能夠同時滿足細胞粘附和注射的需求[1]。PLA濃度是決定粒徑的重要因素, 因此本課題組首先對聚乳酸溶液的濃度進行了篩選。

從圖2可以看出, 隨著PLA溶液濃度的增加, 所得到的微球的平均直徑越來越大。在PLA濃度為10%的時候, 所制備的微球平均直徑約200 μm, 同時分布在(200±20) μm范圍內的微球比例最大, 約為52%。因此, 選取10%的PLA溶液用于后續的微球制備。

對于微球細胞微載體來說, 開放的多孔結構既有利于細胞自由地進出, 也適于氧氣和營養物質的傳輸以及代謝廢物的排出。之前的研究表明, 直徑30~50 μm的大孔, 最適于細胞進入微球內部進行粘附和增殖[1,10-11]。通過調節致孔劑用量, 制備出不同孔結構的BG/PLA微球, 結果如圖3所示。通過微球的SEM照片可以看出, 隨著致孔劑含量的增加, 微球的孔徑越來越大, 內部孔徑之間的貫通性也越來越好。但是, 當致孔劑含量達到8.0%時, 孔結構過大, 會破壞微球的球形結構。而致孔劑用量為6.0%時, 所制備的微球既能維持大量30~50 μm的大孔, 微球也能維持完整的結構, 是最適宜的用量。

如圖4所示, 對孔徑的進一步定量統計結果也表明, 隨著致孔劑含量的增加, 微球上孔的平均孔徑也會依次增加。當致孔劑的用量為6.0%時, 微球上直徑30~50 μm的大孔比例最高, 約為7%。同時, 大量小孔的同時存在也有助于營養物質的傳輸和代謝廢物的排出。因此, 本課題組選取6.0%致孔劑用量用于后續的微球制備。

上述結果表明, 通過篩選適宜的PLA濃度和致孔劑用量, 可以通過復乳法制備出粒徑和孔結構都適宜的多孔微球, 滿足體外細胞三維培養對微載體結構的要求。這一方法解決了生物玻璃難以塑型的難題, 為生物玻璃材料在組織工程中的應用提供了一種新的形式。

圖2 PLA濃度為(a) 5.0%、(b) 7.5%、(c) 10.0%、(d) 12.5%的BG/PLA微球的粒徑分布

圖3 致孔劑用量為(a) 2.0%、(b) 4.0%、(c) 6.0%、(d) 8.0%的BG/PLA多孔微球

圖4 致孔劑用量為(a) 2.0、(b) 4.0、(c) 6.0、(d) 8.0%的BG/PLA微球的孔徑分布

2.2 復合微球中生物玻璃的含量及Si離子釋放

本課題組通過復乳法得到了具有多孔結構的微球, 但是, 單純通過SEM照片還無法確定生物玻璃顆粒是否復合在微球當中。生物玻璃主要通過釋放活性Si離子來發揮其促進細胞增殖、遷移和分化的生物活性。因此, 首先通過熱重分析, 來確定微球是否含有生物玻璃。

結果如圖5所示, 純PLA微球在溫度升高以后, 其有機高分子PLA會迅速降解和揮發, 在700 ℃時,殘余的質量幾乎為零。而無機的生物玻璃在加熱以后, 質量變化很小, 在700 ℃時, 殘余的質量約為最初質量的96.2%。在BG/PLA復合微球中, 溫度升高以后, PLA的降解揮發造成質量迅速下降, 但是BG則使得質量不會降為0, 在700 ℃時, 殘余質量為初始質量的4.8%。通過上述結果, 可以計算出, 在復合微球當中聚乳酸的質量約為95.0%, 生物玻璃的質量約為5.0%。

圖5 BG/PLA復合微球的熱重分析圖

生物玻璃當中含有鈉、鈣、硅和磷等多種元素, 可以釋放多種離子。但是, 其促進細胞增殖、遷移等主要是通過釋放活性Si離子來實現的[13,18]。因此, 本課題組對復合微球活性Si離子的釋放進行了測定。結果如圖6所示, BG/PLA復合微球可以穩定釋放Si離子, 濃度在1.2~2.2 μg/mL范圍內。這說明, 生物玻璃與PLA復合以后, 仍然可以通過釋放活性離子來發揮其生物活性。

上述的熱重分析和離子釋放結果進一步證明了生物玻璃成功地復合到多孔微球當中, 并且仍可通過釋放Si離子來發揮其生物活性。同時, 與之前報道的純生物玻璃微球相比, 其Si離子釋放速率顯著降低, 避免了濃度過高對于細胞的抑制, 從而有利于其發揮良好的生物活性。

2.3 體外細胞實驗

為了考察引入生物玻璃對細胞在微載體上粘附和增殖的影響, 本課題組分別用生物玻璃的PLA微載體與BG/PLA微載體進行體外細胞擴增, 比較其細胞粘附和增殖情況。

結果如圖7所示, 在沒有生物玻璃的PLA微載體上, 細胞也可以進行粘附和增殖, 但是細胞的數量相對較少, 并且多分布于微載體的表面, 進入內部多孔結構的細胞數量較少。而在BG/PLA微載體上, 不但細胞數量有了顯著增加, 分布也更加廣泛。這說明生物玻璃的引入, 增加了微載體擴增細胞的效率。

此外, 本課題組還采用CCK8對細胞的活性進行了定量分析。結果如圖8所示, BG/PLA微球上的細胞比純PLA微球上的細胞具有更高的活力。這說明生物玻璃可以明顯地提高細胞活性, 提高了細胞體外擴增的效率。

細胞進入微球內部, 既可以拓寬增殖的空間, 又能減少注射時細胞所受的傷害, 是評價微球細胞微載體的重要指標[5]。為了進一步研究細胞是否真正進入BG/PLA微球細胞微載體內部, 本課題組在微球上分別選取不同深度的截面進行分析。如圖9所示, 在BG/PLA復合微球細胞微載體的不同深度截面上均有大量的細胞粘附, 而且存在細胞的面積與微球相應的截面積相當, 說明細胞在微球細胞微載體三維結構中粘附和增殖良好。

圖6 BG/PLA復合微球的Si離子釋放

圖7 (a)PLA微球和(b)BG/PLA微球上細胞的活死染色照片

圖8 細胞在微球上的增殖

圖9 細胞在BG/PLA微球不同截面上的分布

體外細胞實驗結果表明, BG/PLA微球能夠有效地促進細胞的擴增。通過釋放活性Si離子, BG/ PLA微球貫穿的大孔結構提供了更大的空間, 從而能夠快速擴張細胞, 滿足組織工程的需求。同時, 微球的剛性結構和活性離子還可以為進入其內部的細胞提供良好的保護作用, 避免其在后續的注射過程中受到摩擦損傷。對于細胞在生物組織中的駐留, 更好地修復受損組織具有重要意義。

3 結論

1) 采用復乳法將生物玻璃與聚乳酸復合, 能夠獲得具有適宜直徑和貫通大孔結構的復合微球。

2) BG/PLA復合微球細胞微載體能夠穩定地釋放活性Si離子, 促進細胞在其表面的粘附和增殖。

3) 細胞既可以在BG/PLA復合微球的表面增殖, 還可以進入其大孔內部, 大大提高了細胞擴增的效率。

4) 本研究所制備的復合微球細胞微載體既能夠體外擴增細胞, 又具有合適的粒徑滿足注射的需求, 在組織工程領域具有廣闊的應用前景。

本研究通過細胞體外實驗初步驗證了BG/PLA復合微球在促進細胞粘附及增殖方面的優勢。但仍有一系列科學問題有待進一步研究, 比如: 細胞進入到BG/PLA微球內部結構以后, 這一特殊的離子和結構環境對細胞有何影響; BG/PLA復合微球釋放的活性硅離子能否促進細胞在體內組織中的駐留和定向分化等。通過系統的體內外生物學實驗來回答這些科學問題以后, 可以進一步實現BG/PLA復合微球在骨、心肌、脂肪等組織修復中的應用。

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Bioglass/Polylactic Acid Porous Microspheres: Preparation and Their Application as Cell Microcarriers

GAO Long1,2, ZHANG Zhaowenbin1,2, CHANG Jiang1,2

(1. Shanghai Institute of Ceramics, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200050, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Porous microsphere cell microcarrier with macroporous structure can not only amplify cells, but also serve as cell delivery tools to deliver cells to damaged tissues by injection. Bioglass (BG) is an inorganic material with excellent biological activity, however, it is difficult to directly prepare microcarriers with macroporous structure. Therefore, in this study, a BG/poly-lactic acid (PLA) porous microspheres was prepared by double emulsion method. The morphology and structure of the microsphere were characterized by SEM, and the load of BG in the microsphere was characterized by thermo gravimetric analysis and its ion release was detected by ICP. Cell proliferation experiments showed that cells could adhere and grow on the surface and inside of the microspheres. The results show that the microsphere with interconnected open-pore microstructure is suit for cell adhesion and proliferation. Bioglass can promote cell proliferation in the microspheres and the obtained BG/PLA composite microsphere has great potential applications in tissue engineering.

porous microsphere; bioglass; polylactic acid; cell microcarrier; tissue engineering

R 318.08

A

1000-324X(2020)10-1163-06

10.15541/jim20190593

2019-11-23;

2019-12-19

國家重點研發計劃(2016YFC1100201); 中國科學院戰略性先導科技專項(XDA16010203) National Key Research and Development Plan of China (2016YFC1100201); The Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences (XDA16010203)

高龍(1988–), 男, 博士研究生. E-mail: gaolong@sina.cnGAO Long (1988–), male, PhD candidate. E-mail: gaolong@sina.cn

常江, 研究員. E-mail: jchang@mail.sic.ac.cn CHANG Jiang, professor. E-mail: jchang@mail.sic.ac.cn