靛玉紅及其衍生物的合成與研究進展*

姬長安，于 健，嚴國兵

(麗水學院化學系，浙江 麗水 323000)

腫瘤(tumor)/癌癥(惡性腫瘤)是目前威脅人類健康的最大殺手，腫瘤的治療方式有三種：放療、化療和手術，放療、化療為常用抗腫瘤療法，主要通過細胞毒性藥物來殺死癌細胞，但對人體健康細胞的傷害較大，而且腫瘤還會復發。隨著醫學技術的進步，只針對腫瘤細胞的特異性靶點藥物治療方式引起了人們的廣泛關注，即針對腫瘤或各種疾病發生時體內的個別蛋白激酶異常表達，誘導細胞變異，參與變異細胞、腫瘤細胞核酸的編譯、轉錄等等，是細胞非正常再生、表達的最直接誘因，所以直接針對這些激酶進行抑制，就可以達到抑制腫瘤細胞的作用。不僅是癌癥，還有糖尿病、阿茲海默癥(AD)等等，都是由于特定激酶的異常表達[1]。

人體有30%的蛋白質含有共價鍵結合的磷酸鹽結構，蛋白質磷酸化被認為是細胞精細調節代謝和調控途徑的主要翻譯后機制之一，蛋白激酶利用ATP或GTP作為磷酸鹽供體催化蛋白質的磷酸化。蛋白激酶的異常表達會導致蛋白質的異常磷酸化，這往往是多種人類疾病如癌癥、糖尿病、AD等的誘因。人體內有500多種激酶，其中有兩類激酶被特別研究：細胞周期素依賴激酶(CDKs)和糖原合成酶激酶-3(GSK-3)。一些CDKs(CDK1，2，4，6)能控制細胞分裂周期和凋亡，常見于癌癥患者體內；另一些CDKs(CDK5，11)參與神經系統各項功能，如CDK5在AD和其他神經退行性疾病中異常表達。GSK-3參與細胞程序化死亡，異常表達于腫瘤、糖尿病、AD等等[1]，是許多此類疾病的診斷特征之一。因此，各種激酶抑制劑的研究，成為了當下抗腫瘤醫藥的熱點。

靛玉紅(Indirubin，圖1)是靛藍(indigo)的同分異構體，屬于雙吲哚生物堿類化合物，是中藥當歸龍薈丸的主要成分之一，主要用于治療慢粒白血病。近年來研究發現靛玉紅及其衍生物對實體乳腺癌、肝癌、肺癌等實體腫瘤和血液系統腫瘤均具有抗腫瘤活性，在炎癥、神經系統疾病、自身免疫性疾病等方面也有作用，所以，靛玉紅在抗腫瘤、抗炎、神經藥物開發等方面有著很大的發展前景[2]。

圖1 靛玉紅(a)與靛藍(b)結構式

通過對靛玉紅母核進行各種取代修飾，能有效抑制CDKs、GSK-3激酶的表達，從而抑制腫瘤細胞的生長、增殖等。靛藍化合物是常用的蛋白激酶抑制劑，通過與ATP、GTP結合的競爭作用產生作用，是良好的激酶抑制劑。

1 靛玉紅的合成

由于靛玉紅很早就被發現有藥用價值，早期靛玉紅的獲取是從馬藍、蓼藍和菘藍等含靛藍高的植物中提取，因靛玉紅在植物體內含量低，水溶性差，提取分離的成本高，所以此方法收率低，大都采取合成法[3-10]，當然，也有人員提出了產率比較好的微生物提取法[11](大腸桿菌培養提取靛玉紅)，為靛玉紅生產提供了可能的新途徑。目前比較普遍的靛玉紅合成方法是靛紅(isatins)和吲哚乙酸酯縮合反應，酸性堿性的選擇是根據所合成靛玉紅衍生物的特性，堿法的適用范圍大些，所以大都采用堿催化法(圖2)，此方法操作簡單，條件溫和，收率較高[12]。而合成4取代靛玉紅時，用酸法產率高[9]。靛玉紅衍生物的合成通常是選用不同取代的靛紅和吲哚，再用此法反應。

圖2 碳酸鈉催化靛玉紅合成反應

近幾年，有人報道了一個合成靛玉紅的新方法[12]。Wang等總結了近十幾年來靛玉紅的5種合成方法，并提出使用KBH4一步還原歐聯法制備靛玉紅(圖3)。經條件篩選，乙醇作溶劑效果最好，KBH4也可以用NaBH4代替，活性相似，且對于此反應，閉口反應時無產物或產率極低，所以要敞口在氧氣的條件下反應。此法產率可以達到90%，操作簡單，適用范圍廣，比傳統合成方法更具有潛力。

圖3 KBH4催化一步法合成靛玉紅

圖4 KBH4催化反應機理

由于靛玉紅水溶性差，導致細胞吸收不良，活性降低，且不易提純與制劑，所以人們的關注點逐漸從靛玉紅轉移到靛玉紅-3’-肟(肟醚)化合物上面來。最開始靛玉紅親水性的改進時在苯環引入羥基、酸基等親水基團，但是這些基團活性提升小，拓展空間有限。在靛玉紅3’位引入肟基(=N-OH)或醚肟(=N-O-R)(圖5)，含有了靛紅肟骨架，不僅改善了親水性，還增加了其生物活性，能表現出更多藥理活性，在醚肟R基基礎上引入其他活性基團(烯烴類、環氧化物、胺環類等等)，使其表現出更多的生物活性，力求更多的臨床價值。

圖5 靛玉紅肟的合成

2 靛玉紅的生物活性與構效關系

由于靛玉紅的抗腫瘤活性是近十幾年才研究發現的，所以迄今為止靛玉紅的生物活性研究報道并不多，由于其在生物體內較好的配位能力以及較好的拓展性，人們的研究主要集中在其對CDKs、GSK-3等的選擇性抑制及其作為先導化合物的各種取代改性上，常見的CDKs抑制劑是作CDK2和CDK5抑制劑，因為CDK5和GSK-3同樣都是是作為AD患者的診斷特征之一。

較早的研究如Polychronopoulos等[1]利用分子模型研究了各種靛玉紅結構在ATP口袋中的選擇性結合情況，此模型的提出方便了日后人們對靛玉紅的選擇性抑制研究。對靛玉紅進行取代修飾時，在5、5′、3′位等引入取代基往往對活性有較大影響，是研究靛玉紅構效關系的首選。Wu等[13]利用大腸桿菌研究了靛玉紅衍生物對GSK-3激酶的抑制活性，對靛玉紅母核取代修飾，并得到了一種抑制效果較好的化合物(圖 6)，可見在5、5′位引入酯基等比較顯著的提高了靛玉紅的抑制活性。

圖6 靛玉紅母核5、5′位修飾

圖7 靛玉紅母核的生物結合關系

Jautelat等[14]研究靛玉紅結構對CDK2的抑制活性，找尋其構效關系，他們利用計算機建模，根據X射線觀察出的靛玉紅與CDK2結合后的結構數據，發現只有5、3′、4′、5′位容易取代(圖7)，而在1、6、7、6′、7′位取代則會導致失活，確定了5位指向極性三磷酸鹽通道、3′位指向核糖口、5′位指向核糖口末端的含水環境，通過修飾這幾個位置不僅改變靛玉紅極性來增強親水性，還能增加與ATP的親和力。他們在5位引入磺酰基和磺酰胺基，在3′為引入肟醚結構，改變化合物結晶性和水溶性，活性顯著增加。

Moon等[3]研究新的靛玉紅衍生物對乳腺癌細胞的抗增殖活性，在5位引入F、Cl、OCF3等等，均有較好的抑制效果，在5位引入酰胺基(圖8)，R基含有叔丁基結構時比含烷基結構活性高，R基位苯環化合物取代時，大都無活性。他們還對多種癌細胞菌株(A 549、SNU-638、Col2、HT 1080、HL-60和MCF-7)進行抑制觀察，發現靛玉紅有會選擇性抑制性。

圖8 靛玉紅引入肟基、酰胺基

Beauchard等[4]研究新的5取代靛玉紅衍生物對CDK1、CDK5、GSK-3等的抑制活性，抑制效果顯著，還在N1位引入甲基進行對照研究，但效果較差，可能是因為增加了位阻。Ferandin等[15]研究了3’-取代-7-鹵代靛玉紅，因為發現其具有優異的細胞死亡誘導屬性，發現7位鹵素取代對CDKs和GSK-3幾乎沒有效果，他們推測是因為7位取代阻礙了靛玉紅與受體結合，也應了上文Jautelat等的報道。Beauchard等[6]研究對比了5、7雙取代和6取代靛玉紅的選擇性抑制關系，發現6位取代靛玉紅對GSK-3有較高選擇性，5位取代對CK1有較高選擇性。

Magiatis等[16]研究了靛玉紅衍生物在神經退行性疾病方面的藥物活性，通過檢測小鼠大腦內紋狀體單胺類物質的消耗，來觀測其效果，除了研究5位、6位的溴取代-3′-肟外，發現在5位引入氨基能增強CDK5抑制活性，還在此基礎上合成了新的5-氨基-6-溴靛玉紅，得出靛玉紅可能對海人酸(KA)所致的伸進系統損傷具有保護作用，因為這些神經毒素(KA、MPTP等)都與CDK5相關。

Choi等[17]為了更進一步增強靛玉紅抗癌活性，在5、5’位用羥基、硝基和氟類等基團拓展，受到之前研究的強效抑制劑5-硝基-5′-溴靛玉紅-3′-肟啟發，合成了5-硝基-5′-羥基和5-硝基-5′-氟等靛玉紅-3′-肟衍生物，作為CDK1和CDK5抑制劑有較好的抗癌效果，5-硝基-5′-羥基靛玉紅-3′-肟(圖9)對CDK的選擇性和抗腫瘤活性是同參與測試激酶的500倍。構效關系表明，5′位為羥基和鹵素時，抑制活性優于甲基、甲氧基等供電子基團。

圖9 靛玉紅肟5、5′號位修飾

Cheng等[8]在5位引入羧酰胺，制備了一系列新的靛玉紅、靛玉紅肟、靛玉紅肟醚等衍生物(圖10)，能與水質子化，使其有更好的水溶性，增強了其抗增殖活性。

圖10 水溶性靛玉紅骨架(R為各種-N類)

Saito等[10]研究甲氧基靛玉紅衍生物在誘導神經母細胞瘤細胞死亡的細胞毒性，得出5′-甲氧基靛玉紅對誘導神經母細胞瘤細胞死亡有著高特異性，可能開發為治療神經母細胞瘤藥物。Myrianthopoulos等[18]提出一種新的反結合模式，即采用倒置結合的方式與受體結合，他們發現當靛玉紅7位為溴取代、5′位為羧酸類基團時，靛玉紅對DRYK(雙特異性酪氨酸磷酸化調節激酶，參與AD、唐氏綜合癥等神經性病理)激酶表現出有效的選擇性抑制。Jung等[19]研究了靛玉紅衍生物作為體細胞轉分化誘導劑的活性，他們發現5-硝基-5′-羥基-靛玉紅-3′-肟有高效的轉分化活性，優于其他分子，且無潛在致癌和免疫原性iPSC轉錄的表達，可作為細胞編程的分子工具。Yan等[20]發現了靛玉紅-3′-肟衍生物對CDK9有較好的抑制活性，其中效果最好的是5-甲氧基-5′,6′-二氟靛玉紅-3′-肟醚(圖11)。Jung等[21]研究了靛玉紅衍生物作為一種新的DRAK2抑制劑的活性，是5-酰胺基靛玉紅-3′-肟骨架，在酰胺基變換(圖8)。

圖11 引入鹵素和肟醚結構

Cheng等[22]在研究靛玉紅衍生物作為胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)的抑制劑時，進一步研究了靛玉紅親水性與取代位的關系，研究了5′位的基團耐受性，發現5′位取代基不能像3′位可以容忍較大基團和剛性基團而不影響活性，5′位有限的修飾空間會導致化合物整體細胞毒性和水溶性降低，他們研究合成了有效的、水溶性好的IGF-1R抑制劑(圖12)。

圖12 含靛玉紅母核的水溶鹽

Ichimaru等[23]合成了一種靛玉紅新結構(圖13)，發現其具有長效抗癌活性和環氧水解酶自殺抑制活性，此結構中，環氧結構的引入可與蛋白質共價連接，表現出的細胞毒性可與順鉑相媲美(以HepG2細胞實驗)。他們發現溴取代除6′位的芳環位都能提高抗癌活性，5位溴取代的活性最好，5位溴取代活性好于氟、氯、碘，5位甲氧基取代時活性也優于其他位。

圖13 肟醚結構引入溴

Kosuge等[24]也研究了靛玉紅結構對神經退行性疾病的治療作用，是研究靛玉紅衍生物對內質網應激誘導產生的神經系統疾病的保護作用。

3 結 語

靛玉紅以其出色的抗腫瘤生物活性和可拓展性，使其成為近幾年抗腫瘤靶向藥物極具研究價值的藥物前體，其本身具有良好的生物結合性，是一種更好的、新的激酶抑制劑，適當、準確的對其加取代修飾，可使靛玉紅發揮更好的生物活性，還可以通過特殊的基團或C位修飾，讓其表現出獨特的特異性細胞毒性和靶標選擇性，可對多種激酶的選擇性抑制，具有很大的研究價值和發展潛力。但近十幾年的研究只是大概推斷出其藥理活性以及其作為多種抗癌、神經疾病藥物的可能性，對其構效關系的探究也沒有十分準確的解答，因為合成的困難，靛玉紅的修飾多停留在3′位、5位等，取代的基團也相對較簡單，對其生物方面活性的研究也有待深入。因此，進一步探究靛玉紅衍生物的準確構效關系，提高其生物活性與選擇性，將成為日后靛玉紅衍生物研究發展的重點。