基于MDCK懸浮細(xì)胞灌注培養(yǎng)的流感病毒生產(chǎn)過(guò)程開(kāi)發(fā)

吳熠瀟 Thomas Bissinger Yvonne Genzel 劉旭平 Udo Reichl 譚文松

（1. 華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2. Max Planck Institute for Dynamics of Complex Technical Systems，

Germany 39106）

相較于傳統(tǒng)的雞胚生產(chǎn)法，用動(dòng)物細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)流感疫苗正在逐步成為主流生產(chǎn)方式［1］。近年來(lái)，季節(jié)性流感疫苗的市場(chǎng)需求正在逐步上升，且在眾多接種率較低的國(guó)家也有巨大的潛在市場(chǎng)開(kāi)發(fā)前景。自2009年后無(wú)大流行流感爆發(fā)，卻依然對(duì)人類(lèi)社會(huì)存在潛在威脅［2-3］。盡管面對(duì)日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求和能快速應(yīng)對(duì)大流行流感病毒爆發(fā)的需求，細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)流感病毒存在著產(chǎn)能低下的問(wèn)題，制約了這一技術(shù)的革新與發(fā)展，因此迫切需要提高細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)流感疫苗的工作效率，主要涉及細(xì)胞株篩選、培養(yǎng)基優(yōu)化、過(guò)程優(yōu)化及強(qiáng)化等方面［4］。

灌注培養(yǎng)是實(shí)現(xiàn)過(guò)程強(qiáng)化提高過(guò)程效率的重要方法之一，相較于傳統(tǒng)的批培養(yǎng)和補(bǔ)料培養(yǎng)因其小體積大產(chǎn)能的優(yōu)勢(shì)廣泛研究于抗體生產(chǎn)領(lǐng)域［5］。灌注培養(yǎng)過(guò)程通過(guò)灌注速率控制策略對(duì)培養(yǎng)體系進(jìn)行補(bǔ)液，同時(shí)以相同的流速將陳舊的培養(yǎng)液排出，卻將細(xì)胞通過(guò)截留裝置留在反應(yīng)器內(nèi)。近幾年來(lái)該技術(shù)也逐漸被應(yīng)用于病毒疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域來(lái)提高病毒產(chǎn)量、過(guò)程效率和經(jīng)濟(jì)性［6］。目前已有報(bào)道通過(guò)使用基 于AGE1.CR、CAP、PER.C6、HEK293、MDCK、PBG.PK2.1等細(xì)胞介質(zhì)的灌注培養(yǎng)過(guò)程來(lái)生產(chǎn)流感病毒，病毒對(duì)于細(xì)胞介質(zhì)的敏感性和病毒產(chǎn)量均存在差異［7-10］。MDCK細(xì)胞目前仍被認(rèn)為是最適用于流感病毒擴(kuò)增的細(xì)胞介質(zhì)之一，但至今使用MDCK懸浮細(xì)胞的高密度培養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)流感病毒的高效和快速擴(kuò)增還鮮有報(bào)道［11-12］。

本研究以懸浮MDCK細(xì)胞株為試驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)病毒馴化獲得適于在該MDCK細(xì)胞株中擴(kuò)增的工作種毒，繼而采用稀釋流加的策略評(píng)估其在低密度下的生長(zhǎng)和產(chǎn)毒表現(xiàn)。然后引進(jìn)Semi-perfusion模型來(lái)模擬MDCK細(xì)胞高密度生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的可行性并研究MOI和胰酶濃度對(duì)病毒復(fù)制的影響，最后將優(yōu)化的操作參數(shù)應(yīng)用于反應(yīng)器體系的ATF灌注培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞高密度生長(zhǎng)和病毒高效率擴(kuò)增。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.2 病毒株 原始種毒為模式甲型流感A/Puerto Rico/8/34病毒株（德國(guó)Robert Koch Institute），早期在MDCK貼壁細(xì)胞（英國(guó)ECACC）傳代，隨后在該MDCK懸浮株中適應(yīng)傳代，其TCID50值為1.8×109virions/mL。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1.1 搖瓶培養(yǎng) 種子細(xì)胞傳代：MDCK懸浮細(xì)胞以0.5×106cells/mL的密度接種于工作體積為30 mL的搖瓶中（Corning），置于37℃，5%的CO2條件下進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速100 r/min，每隔3 d使用Xeno-CDM1傳代一次。搖瓶批式培養(yǎng)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDCK種子細(xì)胞以1.0×106cells/mL的密度接種于搖瓶中，工作體積為30/50 mL，培養(yǎng)至48 h用于病毒馴化或72 h用于稀釋流加病毒感染或48 h用于semi-perfusion培養(yǎng)。使用培養(yǎng)基為Xeno-CDM1。搖瓶高密度（Semi-perfusion）培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDCK種子細(xì)胞以1.0×106cells/mL的密度接種于搖瓶中，工作體積為50 mL，培養(yǎng)至48 h用于后續(xù)Semi-perfusion培養(yǎng)。使用培養(yǎng)基為Xeno-CDM1。

1.2.1.2 生物反應(yīng)器中培養(yǎng) 將搖瓶中擴(kuò)增完畢的MDCK細(xì)胞以1.0×106cells/mL的密度接種到1 L DASGIP 反應(yīng)器中，工作體積為500 mL，細(xì)胞生長(zhǎng)至62 h時(shí)開(kāi)始灌注培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至40×106cells/mL的密度時(shí)以150 mL/h的灌流速度部分更換反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)基，共2 h。細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為 Xeno-CDM2。細(xì)胞生長(zhǎng)階段反應(yīng)器參數(shù)設(shè)置為：pH為7.15±0.02，DO為40%空氣飽和度，溫度為37℃，攪拌轉(zhuǎn)速為80 r/min。

1.2.2 病毒感染

1.2.2.1 搖瓶中的病毒感染 病毒馴化：轉(zhuǎn)移培養(yǎng)至48 h的MDCK細(xì)胞培養(yǎng)液至離心管，全離心換液后轉(zhuǎn)移回125 mL搖瓶進(jìn)行病毒感染實(shí)驗(yàn)，胰蛋白酶添加量為30 U/mL，以MOI為10-5添加貼壁細(xì)胞種毒P0，置于37℃和5% CO2中繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度最高時(shí)收獲病毒液作為下一次馴化的懸浮細(xì)胞種毒P1。重復(fù)上述操作分別獲得種毒P2、P3、P4、P5和P6。P6為后續(xù)病毒感染實(shí)驗(yàn)所用的工作種毒。稀釋流加感染：培養(yǎng)至72 h的MDCK細(xì)胞培養(yǎng)液，在125 mL搖瓶中采用1∶1稀釋流加的方法（15 mL細(xì)胞培養(yǎng)液+15 mL新鮮Xeno-CDM1培養(yǎng)基）進(jìn)行病毒感染實(shí)驗(yàn)。胰蛋白酶添加量為30 U/mL，并以MOI為10-3添加懸浮細(xì)胞工作種毒P6，置于37℃和5% CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)。高密度Semi-perfusion病毒感染：將培養(yǎng)至高密度的細(xì)胞培養(yǎng)液全離心去上清后加入含有30 U/mL或20 U/mL胰酶的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移回125 mL的搖瓶后加入MOI為10-1或10-3的工作種毒。5 h后再次全離心換液，之后按照灌注策略進(jìn)行周期性換液。參數(shù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)組設(shè)置如表1。

表1 感染階段不同操作參數(shù)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置

1.2.2.2 生物反應(yīng)器中的病毒感染 灌注培養(yǎng)中培養(yǎng)基更換結(jié)束后，在反應(yīng)器內(nèi)加入MOI為10-3的種毒和濃度為20 U/mL的胰酶，灌注培養(yǎng)基更換為加入20 U/mL胰酶的Xeno-CDM2。10-20 min等病毒進(jìn)入細(xì)胞后再重新開(kāi)始培養(yǎng)基的灌流。病毒復(fù)制階段反應(yīng)器參數(shù)設(shè)置為：pH為7.20±0.02，DO為40%空氣飽和度，溫度為33℃，攪拌轉(zhuǎn)速為80 r/min。反應(yīng)器pH由CO2和空氣的混合氣體和7.5%的NaHCO3溶液同時(shí)控制。

根據(jù)上文所說(shuō)，我們可以知道銀行作為經(jīng)營(yíng)風(fēng)險(xiǎn)的金融機(jī)構(gòu)，想要在激烈的競(jìng)爭(zhēng)中脫穎而出就要對(duì)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行有效地管理控制。而信貸業(yè)務(wù)是商業(yè)銀行中最為基礎(chǔ)的一個(gè)業(yè)務(wù)，只有保證了信貸風(fēng)險(xiǎn)管理的有效性才能夠更好地保證我國(guó)商業(yè)銀行的正常發(fā)展。銀行只有具備了更強(qiáng)更完善的信貸風(fēng)險(xiǎn)管理體系以及處理風(fēng)險(xiǎn)的能力，才能夠樹(shù)立更加可靠、穩(wěn)健的市場(chǎng)形象，提升企業(yè)在社會(huì)中的影響地位，而且也可以更好地吸引市場(chǎng)中潛在的客戶(hù)群體，有利于企業(yè)更好更持久的發(fā)展，開(kāi)拓了銀行的業(yè)務(wù)。

1.2.3 Semi-perfusion培養(yǎng) 以基于細(xì)胞特異性灌注速率（Cell-specific perfusion rate，CSPR）的灌注速率控制策略通過(guò)在取樣點(diǎn)間周期性的部分離心換液進(jìn)行Semi-perfusion培養(yǎng)，以此滿(mǎn)足細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求。根據(jù)反應(yīng)器中的連續(xù)灌注過(guò)程，換液體積計(jì)算公式：

式中，?t為兩取樣點(diǎn)的時(shí)間間隔（h）；μ為細(xì)胞比生長(zhǎng)速率（h-1）；xi為活細(xì)胞密度（cells/mL）；Vw為工作體積（mL）。

離心換液自接種后48 h開(kāi)始。細(xì)胞計(jì)數(shù)后根據(jù)式（1）計(jì)算換液體積，從搖瓶中取出對(duì)應(yīng)體積的細(xì)胞培養(yǎng)液于離心管中，離心換液后重懸細(xì)胞轉(zhuǎn)移回?fù)u瓶，維持工作體積50 mL。隨著細(xì)胞密度的上升換液體積增大，直至工作體積的60%。從此時(shí)起，固定每次的換液體積，根據(jù)公式（1）不斷縮小換液時(shí)間間隔。計(jì)算時(shí)CSPR選擇為60 pL/cell/d［7］（圖1）。

圖1 搖瓶中semi-perfusion的操作流程示意圖

1.2.4 ATF灌注培養(yǎng) 生物反應(yīng)器與一個(gè)交替切向流（Alternating tangential flow，ATF）過(guò)濾中空纖維柱灌注系統(tǒng)（ATF2，德國(guó)Repligen）相連接。細(xì)胞接種62 h后開(kāi)啟灌注系統(tǒng)和培養(yǎng)基灌流。部分細(xì)胞培養(yǎng)液通過(guò)灌注系統(tǒng)底部隔膜交替的膨脹和收縮在ATF柱子和連接管中往復(fù)運(yùn)動(dòng)，無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)液通過(guò)蠕動(dòng)泵的轉(zhuǎn)動(dòng)透過(guò)ATF膜流向集液瓶。ATF中空纖維膜中的液體流速控制在0.8 L/min。灌注策略中的CSPR為60 pL/cell/d（圖2）。

1.2.5 細(xì)胞計(jì)數(shù) 通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色原理用Vi-CELL（美國(guó)Beckman Coulter）自動(dòng)計(jì)數(shù)儀測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)胞密度和活性。

圖2 基于ATF系統(tǒng)的灌注培養(yǎng)過(guò)程反應(yīng)器裝置設(shè)置

1.2.6 病毒滴度檢測(cè) 總流感病毒顆粒通過(guò)Kalbfuss所報(bào)道的血凝素（Hemagglutinin，HA）滴度檢測(cè)方法測(cè)定［13］。HA滴度以log10表示。單細(xì)胞病毒產(chǎn)量（CSVY）計(jì)算如公式（2），單位為virions/cell。

式中，xv，max為病毒復(fù)制階段的最大活細(xì)胞密度（cells/mL）；HA為 血 凝 素 滴 度［log10（HAU/100 μL）］。

由于病毒復(fù)制階段的多次換液造成的部分病毒液收獲，需要計(jì)算累積HA滴度，才能對(duì)應(yīng)反應(yīng)器中的連續(xù)灌注過(guò)程。計(jì)算公式如式（3）。

式 中，HAacc為 累 積HA滴 度（log10（HAU/100 μL）；HAh為每次病毒收獲液測(cè)得的HA滴度（log10（HAU/100 μL）；Vh為每次病毒收獲液的體積（mL）。

感染性病毒顆粒根據(jù)Genzel和Reichl報(bào)道的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）檢測(cè)方法測(cè)定，單位為virions/mL［14］。

1.2.7 胞外代謝物檢測(cè) 葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和氨的濃度由Bioprofile 100 plus（美國(guó)Nova medical）通過(guò)外部標(biāo)樣校準(zhǔn)檢測(cè)得到。

2 結(jié)果

2.1 流感病毒在MDCK懸浮細(xì)胞中的馴化

將實(shí)驗(yàn)室早期已適應(yīng)于MDCK貼壁細(xì)胞的流感病毒以低MOI 10-5的盲傳方式在該MDCK懸浮細(xì)胞中進(jìn)行馴化。經(jīng)過(guò)5代馴化之后的結(jié)果如圖3所示。HA檢測(cè)法表征培養(yǎng)液中的總病毒顆粒數(shù)。由圖3-A可知，每一代的HA滴度都呈現(xiàn)先上升后平穩(wěn)的趨勢(shì)（除第3代），達(dá)到最大HA值的時(shí)間第5代相較第1代縮短了24 h（第1代為60 h，第5代為36 h），表明馴化之后，病毒對(duì)細(xì)胞的感染與自我復(fù)制速率明顯加快。5次病毒傳代的最大HA滴度分別為3.52、3.49、3.33、3.60、3.59 log10（HAU/100 μL），在 整個(gè)馴化過(guò)程中最大HA保持穩(wěn)定。TCID50檢測(cè)法用來(lái)定量培養(yǎng)液中的感染性病毒顆粒數(shù)。由圖3-B可知，每一代的TCID50滴度在達(dá)到最大值后出現(xiàn)了下降的現(xiàn)象，病毒復(fù)制過(guò)程中的最大TCID50滴度分別為1.78、1.33、1.78、3.16×109virions/mL，表明了馴化過(guò)程并沒(méi)有導(dǎo)致感染性病毒顆粒數(shù)的顯著減少，而是維持了穩(wěn)定的水平。

圖3 流感病毒在MDCK懸浮細(xì)胞馴化過(guò)程中的HA滴度（A）和TCID50滴度（B）變化

2.2 稀釋流加培養(yǎng)條件下的流感病毒生產(chǎn)

經(jīng)過(guò)病毒馴化獲得了能在該MDCK細(xì)胞中快速增殖的種子病毒后，在搖瓶中進(jìn)行了該細(xì)胞在稀釋流加策略下的生長(zhǎng)和產(chǎn)毒表現(xiàn)，結(jié)果如圖4所示。由圖4-A可知，在細(xì)胞生長(zhǎng)階段，當(dāng)以1×106cells/mL的密度接種時(shí)，72 h后細(xì)胞密度達(dá)到（10.35±1.07）×106cells/mL，在此期間呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，平均比生長(zhǎng)速率和倍增時(shí)間分別為0.033 h-1和21 h；細(xì)胞活性維持在（97.7±0.57）%以上。病毒感染前，由于培養(yǎng)基的1∶1補(bǔ)充細(xì)胞密度減半；在病毒復(fù)制階段細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)一段時(shí)間后由于病毒的釋放和細(xì)胞的裂解細(xì)胞密度和活性都迅速下降。由圖4-B可知，病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制速度快且效率高，在24 hpi時(shí)便幾乎完成了增殖和釋放過(guò)程，最大HA滴度為（3.57±0.17）log10（HAU/100 μL）。通過(guò)公式（2）計(jì)算可得到搖瓶批培養(yǎng)中的病毒感染過(guò)程的CSVY為（11 225±1 832）virions/cell。

圖4 搖瓶中稀釋流加培養(yǎng)條件下的細(xì)胞密度和活性（A）以及HA滴度（B）

2.3 Semi-perfusion中MDCK細(xì)胞的高密度生長(zhǎng)與流感病毒生產(chǎn)可行性

分析了該MDCK懸浮細(xì)胞低密度生長(zhǎng)和產(chǎn)毒過(guò)程的特征后，展開(kāi)了以搖瓶為縮小模型去模擬灌注過(guò)程中細(xì)胞高密度培養(yǎng)條件下（＞15×106cells/mL）生產(chǎn)流感病毒的可行性分析，考察病毒感染復(fù)制階段不同操作參數(shù)胰酶濃度和MOI在灌注模式下對(duì)于流感病毒擴(kuò)增的影響，并同時(shí)關(guān)注流感病毒在高細(xì)胞密度條件下擴(kuò)增時(shí)是否出現(xiàn)CSVY下降的現(xiàn)象，即“高細(xì)胞密度效應(yīng)”，結(jié)果如圖5所示。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)優(yōu)化灌注策略中的CSPR，確定CSPR為60 pL/cell/d以延長(zhǎng)具有高比生長(zhǎng)速率的指數(shù)生長(zhǎng)期，滿(mǎn)足細(xì)胞高密度生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求。如圖5-A所示，在細(xì)胞生長(zhǎng)階段，以1×106cells/mL的密度接種，約130 h后HCD1、HCD2、HCD3三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞可分別生長(zhǎng)至43.2、44.0、46.8×106cells/mL，且隨著細(xì)胞密度的上升，比生長(zhǎng)速率下降，最低時(shí)僅為0.015/h。在病毒復(fù)制階段，僅HCD3實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞在病毒感染后繼續(xù)生長(zhǎng)，且密度維持了一段時(shí)間至34 hpi后由于病毒的累積才開(kāi)始下降，說(shuō)明在高密度情況下高M(jìn)OI的病毒感染與復(fù)制要快于低MOI。通過(guò)比較HCD1和HCD2組，可發(fā)現(xiàn)高胰酶濃度組在病毒感染后細(xì)胞密度出現(xiàn)明顯下降，而低胰酶濃度組密度基本維持穩(wěn)定，說(shuō)明30 U/mL的胰酶濃度對(duì)細(xì)胞的傷害會(huì)比20 U/mL的胰酶濃度明顯。由圖5-B可知，有更高M(jìn)OI的實(shí)驗(yàn)組HCD1和HCD2病毒釋放較早，在13 hpi時(shí)已檢測(cè)到高滴度3.83、3.81 log10（HAU/100 μL），而較低MOI組HCD3在24 hpi才開(kāi)始檢測(cè)到滴度3.72 log10（HAU/100 μL）。3個(gè)實(shí)驗(yàn)組之后由于細(xì)胞的死亡和換液滴度都出現(xiàn)HA滴度下降的趨勢(shì)。比較HCD1和HCD2組發(fā)現(xiàn)了相似的HA滴度生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)，因此所選擇的兩個(gè)胰酶濃度對(duì)于HA生產(chǎn)的影響作用并不大。通過(guò)公式（3）計(jì)算得到的不同實(shí)驗(yàn)組累積HA滴度沒(méi)有明顯差異，分別為4.05、4.19、4.12 log10（HAU/100 μL），而HCD2實(shí)驗(yàn)組的CSVY最高，為7 016 virions/cell，但是仍低于批培養(yǎng)中的CSVY，即出現(xiàn)了“高密度效應(yīng)。”綜合考量，選用MOI 0.001和胰酶濃度 20 U/mL作為后續(xù)反應(yīng)器驗(yàn)證的感染階段參數(shù)。

2.4 基于ATF的生物反應(yīng)器中的灌注培養(yǎng)過(guò)程驗(yàn)證

圖5 Semi-perfusion中不同胰酶濃度和MOI對(duì)MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)（A）、流感病毒HA滴度（B）和累積HA滴度以及單細(xì)胞病毒產(chǎn)量（C）的影響

完成了搖瓶中的細(xì)胞高密度生長(zhǎng)與流感病毒生產(chǎn)的可行性分析后，進(jìn)行了ATF生物反應(yīng)器灌注培養(yǎng)的可行性驗(yàn)證。在Semi-perfusion的結(jié)果基礎(chǔ)上，調(diào)整了培養(yǎng)基的緩沖溶液體系提升了反應(yīng)器的pH控制，同時(shí)也降低了病毒復(fù)制階段的溫度。由圖6-A和6-B可知，在細(xì)胞生長(zhǎng)階段，與Semi-perfusion相似，細(xì)胞在反應(yīng)器中經(jīng)過(guò)136.5 h達(dá)到41.2×106cells/mL的密度，也同樣出現(xiàn)了比生長(zhǎng)速率下降的現(xiàn)象。另外也發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)液滲透壓的下降，細(xì)胞的直徑也相應(yīng)變小。接毒后，由于降溫病毒累積自24 hpi開(kāi)始，至36 hpi時(shí)達(dá)到4.23 log10（HAU/100 μL）。此外，在ATF柱子的透過(guò)液中也檢測(cè)到了HA滴度，表明有部分流感病毒通過(guò)了ATF膜，未截留在反應(yīng)器內(nèi)。通過(guò)計(jì)算得到累積HA滴度為4.37 log10（HAU/100 μL），相 應(yīng) 的CSVY為10 083 virions/cell，說(shuō) 明 反應(yīng)器灌注培養(yǎng)過(guò)程通過(guò)降溫策略可以緩解甚至克服“高密度效應(yīng)”。從圖6-C可知，灌注速率隨著細(xì)胞密度的變化而變化，在細(xì)胞密度最高時(shí)達(dá)到了3.12 RV/d，由于每個(gè)時(shí)間段內(nèi)灌注速率的值根據(jù)該時(shí)間段結(jié)束時(shí)的預(yù)期細(xì)胞密度計(jì)算得到，所以整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程灌注速率呈現(xiàn)一個(gè)階梯式的變化。根據(jù)每個(gè)時(shí)間段所消耗的培養(yǎng)基的體積計(jì)算過(guò)程中實(shí)際的CSPR發(fā)現(xiàn)實(shí)際CSPR在62-84 pL/cell/d之間（除病毒感染前的2 h換液階段），說(shuō)明基于CSPR的灌注速率控制策略效果尚佳。從圖6-D可知，葡萄糖和谷氨酰胺在灌注啟動(dòng)前被消耗，在灌注啟動(dòng)后由于新鮮培養(yǎng)基的補(bǔ)給兩者濃度處于穩(wěn)定的狀態(tài)，分別約為18 mmol/L和3.5 mmoL/L；相應(yīng)地，代謝副產(chǎn)物乳酸和氨在灌注啟動(dòng)前被生成，之后由于灌注過(guò)程中培養(yǎng)基的補(bǔ)入也處于穩(wěn)定的狀態(tài)，約為25 mmol/L和3.5 mmol/L。病毒感染初期階段（<24 hpi），盡管由于培養(yǎng)基的補(bǔ)入，葡萄糖仍被大量地消耗，造成了乳酸的大量生成，高達(dá)35.1 mmol/L。

3 討論

目前用動(dòng)物細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)流感疫苗存在的產(chǎn)能低下問(wèn)題制約了該工藝的發(fā)展，因此提高過(guò)程的生產(chǎn)效率成為了解決這個(gè)問(wèn)題的關(guān)鍵［15-16］。通過(guò)灌注培養(yǎng)模式來(lái)實(shí)現(xiàn)過(guò)程強(qiáng)化是提高病毒生產(chǎn)效率的有效途徑之一［17］。本研究以一株MDCK懸浮細(xì)胞株為研究對(duì)象，通過(guò)病毒馴化，批培養(yǎng)驗(yàn)證以及灌注培養(yǎng)過(guò)程開(kāi)發(fā)，成功地建立了一個(gè)高效的流感病毒生產(chǎn)平臺(tái)，成果討論歸納于表2。

3.1 病毒馴化是疫苗生產(chǎn)過(guò)程的必要步驟

流感病毒在細(xì)胞內(nèi)的馴化通常采用低MOI，因?yàn)楦進(jìn)OI的情況下會(huì)產(chǎn)生更多的無(wú)感染性且不完整的缺陷型病毒顆粒（DP），其中的缺陷型干擾顆粒（DIP）會(huì)進(jìn)一步干擾完整病毒顆粒的復(fù)制，導(dǎo)致感染性病毒顆粒的減少［18］。而低MOI情況下生產(chǎn)的種毒感染性顆粒比例更高，因此在作為工作種毒時(shí)使用體積更小，且在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制時(shí)受到DIP的干擾也更小。通過(guò)病毒馴化加快病毒復(fù)制過(guò)程的現(xiàn)象也見(jiàn)于Vero和HEK293細(xì)胞中［19-20］。根據(jù)病毒種類(lèi)的不同，病毒復(fù)制在馴化之后的改善程度也不同，本文中的H1N1株在馴化之后維持了馴化前的病毒滴度，而之前報(bào)道的部分黃病毒如MVA和Zika病毒在馴化之后感染性滴度得到了1個(gè)log的提升［21］。

圖6 ATF灌注培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)胞密度和病毒HA滴度（A）、細(xì)胞直徑和培養(yǎng)液滲透壓（B）、灌注速率和CSPR（C）以及胞外谷氨酰胺、葡萄糖、乳酸和氨的濃度（D）

表2 MDCK細(xì)胞生產(chǎn)流感病毒技術(shù)成果表

3.2 MDCK細(xì)胞作為流感病毒生產(chǎn)基質(zhì)的成功運(yùn)用

提高流感病毒產(chǎn)量的關(guān)鍵在于提高細(xì)胞密度和單細(xì)胞產(chǎn)量。細(xì)胞株篩選、培養(yǎng)基開(kāi)發(fā)和反應(yīng)器過(guò)程控制均可影響細(xì)胞密度和單細(xì)胞產(chǎn)量。本研究中的MDCK懸浮細(xì)胞批培養(yǎng)中生長(zhǎng)密度可至千萬(wàn)級(jí)別，高于目前已報(bào)道的大部分MDCK細(xì)胞［20，22-23］，且它在該培養(yǎng)基中的CSVY高于11 000 virions/cell，這兩者的結(jié)合保證了最終的流感病毒高產(chǎn)量。本研究中獲得的病毒HA高于目前已有文獻(xiàn)報(bào)道使用不同的細(xì)胞介質(zhì)如PER.C6、HEK293、PBG.PK2.1生產(chǎn)流感的其他批培養(yǎng)或稀釋流加培養(yǎng)過(guò)程，再一次驗(yàn)證了MDCK細(xì)胞為最佳的候選株之一用于流感病毒的生產(chǎn)［11］。

3.3 過(guò)程強(qiáng)化實(shí)現(xiàn)了病毒產(chǎn)量的進(jìn)一步提升

灌注培養(yǎng)在病毒疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域近幾年發(fā)展迅速，基于該株MDCK細(xì)胞在低密度培養(yǎng)條件下的優(yōu)良產(chǎn)毒表現(xiàn)，通過(guò)灌注培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)過(guò)程強(qiáng)化，提高病毒產(chǎn)量和產(chǎn)毒效率。以搖瓶或搖管作為Scale-down模型來(lái)模擬實(shí)際反應(yīng)器中的灌注過(guò)程并進(jìn)行高密度培養(yǎng)的過(guò)程的開(kāi)發(fā)與優(yōu)化既可實(shí)驗(yàn)高通量篩選也降低了操作復(fù)雜程度和成本［24］。經(jīng)過(guò)前期的灌注速率優(yōu)化，CSPR為60 pL/cell/d可支持細(xì)胞達(dá)到40×106cells/mL的密度。通過(guò)此模型可獲得更高的細(xì)胞密度，但是也會(huì)由于頻繁的離心與換液造成過(guò)程的不穩(wěn)定，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。由于選擇的灌注策略的影響，細(xì)胞密度達(dá)到一定水平時(shí)換液時(shí)間間隔會(huì)較?。? 4 h），由此會(huì)引起過(guò)程中pH、溫度、滲透壓的不穩(wěn)定，從而影響細(xì)胞生理狀態(tài)。

MOI對(duì)于病毒復(fù)制過(guò)程有重要影響，在此體系中選用高M(jìn)OI可緩解由于不斷的換液操作帶走體系中的病毒顆粒而延緩復(fù)制過(guò)程的問(wèn)題，選用低MOI則可以減少大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)的種毒接種量，也可以減少DIP的產(chǎn)生。本研究通過(guò)比較MOI 0.1和0.001發(fā)現(xiàn)在高密度條件下MOI對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)和病毒復(fù)制的影響與批培養(yǎng)條件有相似性［25］。30 U/mL的胰酶濃度對(duì)細(xì)胞的傷害明顯高于20 U/mL的胰酶濃度，但是并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)病毒產(chǎn)量有明顯的抑制作用。通過(guò)Semi-perfusion得到的>4 log10（HAU/100 μL）的滴度與已有報(bào)道中的另一株MDCK懸浮細(xì)胞株病毒產(chǎn)量相似，但是報(bào)道缺乏反應(yīng)器的灌注過(guò)程驗(yàn)證［7］。

本研究最后進(jìn)行了灌注培養(yǎng)的反應(yīng)器驗(yàn)證及過(guò)程表征，反應(yīng)器中相似的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線驗(yàn)證了Semiperfusion模型模擬反應(yīng)器培養(yǎng)的可行性，且病毒復(fù)制階段的降溫措施提高了CSVY，克服了“細(xì)胞密度效應(yīng)”。根據(jù)已有報(bào)道，盡管流感病毒的直徑（80 nm）小于ATF膜的孔徑（0.2 μm），卻由于膜對(duì)培養(yǎng)液中的細(xì)胞碎片、某些蛋白、DNA和化合物的非特異性吸附幾乎沒(méi)有病毒顆粒可以穿過(guò)ATF膜進(jìn)入到透過(guò)液中［9］。本研究中卻發(fā)現(xiàn)了在透過(guò)液中約有25%的病毒顆粒，原因可能是由于降溫措施減少了培養(yǎng)液中的宿主細(xì)胞蛋白和DNA水平，仍需進(jìn)一步檢測(cè)培養(yǎng)液蛋白和DNA濃度進(jìn)行驗(yàn)證。最終獲得的累積HA滴度為現(xiàn)有應(yīng)用反應(yīng)器灌注培養(yǎng)過(guò)程生產(chǎn)流感病毒的報(bào)道中最高，而采用MDCK細(xì)胞更是首次［8］。目前過(guò)程中的灌注速率控制是為半連續(xù)，需要人工階段性地根據(jù)細(xì)胞密度調(diào)整灌注速率，后期的研究可以根據(jù)PAT的理論引入在線活細(xì)胞密度檢測(cè)體系去實(shí)現(xiàn)灌注速率自動(dòng)化控制。此外，代謝物檢測(cè)發(fā)現(xiàn)病毒感染階段乳酸產(chǎn)量較高（約35 mmol/L），其對(duì)病毒產(chǎn)量的潛在影響尚不能確定。培養(yǎng)基的“深度”（Depth in medium）優(yōu)化可改善病毒復(fù)制階段的副產(chǎn)物積累問(wèn)題，同時(shí)也有希望降低整個(gè)過(guò)程中的CSPR，從而降低培養(yǎng)基消耗量和提高過(guò)程經(jīng)濟(jì)性［5］。

4 結(jié)論

低MOI的病毒馴化可明顯加快病毒在細(xì)胞內(nèi)的感染與復(fù)制進(jìn)程，且不影響總病毒滴度和感染性病毒滴度。搖瓶中的稀釋流加培養(yǎng)可使細(xì)胞密度達(dá)千萬(wàn)級(jí)別，病毒滴度達(dá)（3.57±0.17）log10（HAU/100 μL）。通過(guò)Semi-perfusion模型驗(yàn)證了MDCK細(xì)胞高密度生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的可行性，且發(fā)現(xiàn)不同MOI和胰酶濃度對(duì)病毒感染復(fù)制有影響作用。最后通過(guò)反應(yīng)器中的灌注培養(yǎng)使細(xì)胞密度高達(dá)40×106cells/mL，病 毒產(chǎn) 量 高 達(dá)4.37 log10（HAU/100 μL），CSVY為10 083 virions/cell，與批培養(yǎng)過(guò)程相當(dāng)。本工作嘗試的結(jié)果提升了流感病毒的生產(chǎn)效率，為基于細(xì)胞培養(yǎng)的流感疫苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了新選擇。