植物Dof基因結構特點及功能研究進展

劉俊 金鈺 吳耀松 劉燕 王文彬 任閃閃 刁松鋒 陳玉龍

（1. 河南中醫藥大學 中醫藥科學院 河南省中醫方證信號傳導重點實驗室，鄭州 450046；2. 河南省林業科學研究院，鄭州 450008；3. 中國林業科學院經濟林研究所 國家林業和草原局泡桐研究開發中心 經濟林種質創新與利用國家林業和草原局重點實驗室，鄭州 450003）

轉錄因子又稱反式作用因子，是一類能夠專一性結合目的基因上游特異核苷酸序列，并具對靶基因有激活或抑制功能的一類含有特殊結構的蛋白。根據轉錄因子對其他基因的調控關系，植物的反式作用因子可以分為兩類，一類可以非選擇性地調控基因的轉錄表達，稱之為非特異性轉錄因子；另一類可以特異性調控下游因子的轉錄翻譯。根據轉錄因子結合域的類型分為不同的基因家族，同時依據保守域的數目及保守域外的功能域，基因家族又分為不同的亞家族［1-2］，如Dof、MYB、MADS、LBD、SAUR、GRF、bHLH、KNOX、WRKY和NAC轉 錄因子家族等。

1 Dof轉錄因子在植物基因組中的分布

ZmDof1是第一個從玉米中克隆出來的Dof基因［3］，隨著人們對轉錄因子的關注和深入研究，更多的Dofs基因從其他物種的基因組數據庫中相繼被預測或克隆出來。隨著基因組學和分子生物學的發展，無論是在高等植物還是在單細胞藻類中發現均有Dof轉錄因子家族，但是不同物種中數量差異較大。本文對已報道的不同物種中Dof轉錄因子的數目進行了統計，結果如表1所示。

2 Dof轉錄因子的結構特點

DNA結 合 單 鋅 指（DNA binding with one zinc finger，Dof）蛋白是植物特有的轉錄因子家族之一，屬于C2C2單鋅指蛋白超家族，因富含一個特別的Cys殘基的單鋅指保守結構域，稱為Dof結構域［37］。Dof蛋白通常由200-400個核苷酸殘基組成，只含有一個拷貝的Dof保守域和兩個結構域組成，N末端高度保守的DNA結合結構域和C尾端轉錄調控域［2，38-41］。結合結構域（Binding domain，BD）是一段高度保守的，由52個氨基酸殘基組成的Dof結構域，在此結構域中CX2CX21CX2C基序形成一個單鋅指結構，單鋅指結構中4個保守的Cys殘基與1個Zn2+共價結合［2，42-44］，一個發生變化，均會導致Dof蛋白活性的喪失，DNA結合結構域能與其他蛋白結合，發生相互作用，是具有重要作用的功能域［45］。由于Dof蛋白的DNA結合域序列保守性較強，所以它們都有著相似的DNA結合特性［46］。C端包含一個具有多種功能的轉錄調控結構域，能與多種調控蛋白相互作用和激活基因表達［26］，該結構域氨基酸保守性較差，不同Dof成員之間變異很大，進而導致Dof蛋白功能的多樣性。Dof蛋白的N端和C端區域可與多種調控蛋白或攔截信號相互作用，激活或抑制下游調控因子［47-48］。

表1 不同物種中Dof基因的分布［4］

3 Dof 轉錄因子的功能

Dof蛋白是只存在于植物體內的一類反式作用因子［49］，擁有豐富的功能。研究表明，Dof轉錄因子參與植物的生長調控、信號傳導、種子萌發、光周期響應、非生物脅迫及開花調控等多種生物學途徑［50-55］。

3.1 生長發育

Dof蛋白參與植物的多種生長發育［56］。在擬南芥中，OBP結合蛋白1（OBF binding protein 1，OBP1）蛋白作為Dof轉錄因子家族成員之一，是首先被報道出來的OCS元件結合因子（OCS element binding factor，OBF），OBP1的過表達導致了細胞周期相關基因顯著上調表達，染色質免疫沉淀實驗證實，OBP1的直接靶點至少包括核心細胞周期基因CYCD3；3和復制特異性轉錄因子基因AtDOF2.3；OBP1在細胞培養中的短期激活影響了細胞周期的重新進入，縮短了G1期的持續時間和細胞周期的總長度，OBP1組成性過表達則影響了細胞的大小和細胞數量，導致植株矮化；在胚胎發生、萌發和側根起始階段的表達表明，OBP1在細胞周期的重新進入中起著重要的作用，是關鍵細胞周期基因的轉錄調控因子［57］。過表達AtDOF5.4/OBP4通過促進內循環的早期發生，抑制細胞的擴增，降低了轉基因擬南芥細胞的大小和數目，導致轉基因植株矮小。因此，OBP4（OCS element binding factor，OBF4）作為一個負調控因子，調節擬南芥細胞的擴張和細胞周期進程［58］，并且OBP4通過與根毛缺陷型RSL2（ROOT HAIR DEFECTIVE6-LIKE2）基因的啟動子結合，抑制RSL2的轉錄，有助于抑制擬南芥根毛依靠脫落酸（Abscisic acid，ABA）的生長［59］。AtDof2.4啟動子在葉片原核、根和胚的原形成層細胞中均有活性，而AtDof5.8啟動子活性在幼苗葉片原核、發育胚胎的子葉和發育花芽的維管組織的前緣靜脈細胞中均有特異性表達，表明AtDof2.4和AtDof5.8在擬南芥不同生長發育過程中發揮不同作用［42，60］；AtDof6的轉錄水平在干燥的種子中積累，在催熟和種子吸脹時逐漸衰減。研究表明，AtDof6對種子萌發起負調控作用，ABA超敏表型以及ABA生物合成基因ABA1和ABA相關脅迫基因的表達增加，酵母雙雜交和雙分子熒光互補實驗結果顯示，AtDof6可以與種子萌發陽性調節因子TCP14發生蛋白互作。在TCP14突變體中，ABA1和與ABA相關的應激基因的表達也增強，表明AtDof6對種子萌發起負調控作用，并與TCP14對一組特定的ABA相關基因的調控功能相違背［61］。AtDof5.6/HCA2（high cambial activity 2）優先在各器官的維管系統中表達，尤其在花序莖的形成層、韌皮部和束間薄壁細胞中，進一步研究表明，HCA2促進束間形成層在花序梗發育的早期階段形成。由此表明AtDof5.6/HCA2參與了擬南芥束間形成層的形成和維管組織發育的調控［62］；AtDof4.7基因在擬南芥的長角果和里層中豐富表達，過表達AtDof4.7基因導致翼瓣和雄蕊的脫落時間明顯推遲，進而影響花器官的脫落［2］，表明AtDOF4.7作為轉錄復合物的一部分參與脫落的控制，直接調控細胞壁水解酶的表達［63］；Dof2.1通過MYC2-Dof2.1-MYC2前饋轉錄環作為JA誘導葉片衰老的增強劑，促進擬南芥葉片衰老［64］。在小麥中，Dof轉錄因子小麥醇溶一谷蛋白盒結合因子（Wheat prolamin-box binding factor，WPBF）是從小麥胚乳中分離到的一種DOF轉錄因子，蛋白質體外結合實驗和雙分子熒光互補實驗結果證明，WPBF可以與TaQM發生相互作用，并且TaQM的表達模式與WPBF相似；在轉基因擬南芥的種子和維管系統中觀察到了WPBF基因的啟動子活性，這與WPBF在小麥中的表達譜一致。由此表明，WPBF不僅在小麥種子發育過程中起作用，在其他生長發育過程中也起作用，具有功能的多樣性［65］。番茄中，SlDOF10參與維管組織的發育，并且在生殖發育過程中發揮重要作用［66］；SlDof1在高度富含保衛細胞的表皮中表達，凝膠阻滯實驗顯示，SlDof1能夠與特異的TAAAG基序相互結合，該結果為TAAAG元件是調控細胞特異性基因表達的Dof蛋白的靶位點提供了證據［67］。超表達35S∷SlCDF3通過提高光合作用和糖的利用，提高了轉基因番茄植株的生物產量，轉錄組分析顯示，CDF3（CYCLING DOF FACTOR 3）基因參與調控氧化還原穩態、光合作用性能和初級代謝相關基因的表達，進而提高生物產量［68］。在大豆中，過表達GmDof11顯著增加了轉基因植株的分枝數、主莖節數和百粒重，并提高了種子含油量及大豆的產量［42，69］。OsDof24和OsDof25能夠調節水稻種子中貯藏蛋白谷蛋白GluB-1基因的表達［70］；過表達OsDof12減少轉基因水稻主支和側支的數目、降低植株高度、葉片直立變短、小穗長度變小。由此說明，OsDof12參與水稻植株結構的形成［71］。

3.2 碳氮代謝

在玉米中，ZmDof1（MNB1a）不僅誘導磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（Phosphoenol pyruvate carboxylase，PEPC）和正磷酸雙激酶（cyPPDK）基因的表達，調控氮的代謝［41，72］，而且超表達ZmDof1導致轉基因擬南芥氮含量提高30%［44］；過量表達ZmDOF36導致轉基因玉米淀粉結構異常，淀粉合成相關基因上調表達，玉米淀粉含量增加，可溶性糖和還原糖含量降低，酵母單雜交結果顯示，ZmDOF36可以直接調控ZmAGPS1a、ZmAGPL1、ZmGBSSI、ZmSSIIa、ZmISA1和ZmISA3基 因 轉 錄［73］；ZmDof3在 體 內外均可與淀粉生物合成基因Du1和Su2啟動子中的Dof核心元件結合。進一步分析表明，ZmDof3的敲除降低了參與糊粉細胞分化的Nkd1的表達，ZmDof3可以與Nkd1啟動子的Dof核心元件結合，表明ZmDof3在玉米胚乳發育過程中起著正向調節作用，在調控淀粉積累和糊粉蛋白發育的信號系統中起著積極的調節作用［74］。OsDof13是ZmDof1的同源基因，該基因也參與低氮脅迫響應［37］，OsDOF18通過誘導水稻根系中氨轉運體來控制植株對氨的吸收［75］。豌豆中，PsDof7基因參與碳代謝，在葡萄糖處理下該基因上調表達［76］。在甘薯中，超量表達Dof類轉錄因子SRF1通過對液泡轉化酶基因的負調控，調節貯藏根的碳水化合物代謝，增加淀粉鮮重在轉基因植株中含量，顯著降低了葡萄糖和果糖所占比重［41，77］。綜上所述，Dof轉錄因子在植物碳氮代謝中發揮了重要作用。

3.3 非生物脅迫

大量研究表明，Dof轉錄因子參與植物的非生物脅迫等抗性反應［47，78］。在擬南芥中，MeJA誘導AtDof1.1基因的表達，表達量上調2-3倍［79-80］，ATDOF5.8通過調控質膜結合NAC蛋白ANAC069來參與鹽脅迫響應［81］，CDF3基因的表達受高鹽、干旱、高溫和ABA的誘導，過表達CDF3提高轉基因擬南芥干旱、低溫和滲透脅迫的耐受程度，縮短轉基因植株的開花時間。然而，缺失表達CDF3（cdf3-KO）引起轉基因植株抗性減弱，CDF3可以調控細胞滲透和活性氧（Reactive oxygen species，ROS）穩態相關基因表達，通過多跨膜結構蛋白GI（GIGANTEA）調節應答植物中糖和氨基酸水平的變化，由此說明，擬南芥CDF3基因在非生物脅迫中發揮了多重作用［82］。在番茄中，SlCDF1-5是擬南芥CDFs的同源基因，在干旱、鹽、熱和低溫處理后，出現不同程度的上調表達，表明SlCDF1-5參與非生物脅迫響應；將SICDF1和SICDF3轉入擬南芥，提高了轉基因植株的抗旱能力［83］。二穗短柄草中，BdCBF1、BdCBF2和BdCBF3通過調節下游靶基因Dhn5.1（DEHYDRIN5.1）和冷相關COR（COLDREGULATED），在寒冷、干旱和鹽脅迫中發揮重要作用［84］。TaDofs參與小麥顆粒發育及非生物脅迫響應，TaDof16、TaDof26和TaDof96在干旱脅迫處理下分別上調2倍、7倍和12倍［85］；在大白菜中，大部分的BraDofs基因的表達受到冷、熱、高鹽度和干旱脅迫的誘導。過表達GhDof1轉基因棉花的耐鹽性和耐寒性明顯高于野生型，鹽脅迫促進GhDof1超表達植株根系的生長，應激反應基因GhP5CS、GhSOD和GhMYB在轉基因株系中的表達水平均有不同程度的上調，部分轉基因植株油含量增加，蛋白質含量降低，表明GhDof1是提高陸地棉非生物脅迫耐受性和籽油含量的功能轉錄因子［86］。在楊樹中，7個基因（PtrDof14、16、25、27、28、37和39）在ABA和滲透脅迫下，在葉片和根中持續上調表達，PtrDof27和PtrDof28在ABA處理中的葉片和根組織中，與擬南芥的同源基因（AT5G66940）具有相似的表達模式，表達量均得到了提高［87］。在剛毛檉柳中，ThDof1.4通過提高脯氨酸水平，增強ROS的清除能力，同時調控ThSODs、ThPODs、ThP5CS1和ThP5CS2基因的表達，顯著提高了轉基因植株非生物脅迫耐受性［88］。

3.4 開花調控

Dof轉錄因子還參與植物開花五大調控途徑中的光周期途徑。在擬南芥中，AtCDFs是開花抑制因子，該基因的表達受光周期的影響［2］。AtCDF1通過與開花誘導因子CO（CONSTANS）和成花基因FT（FLOWERING LOCUS T）啟動子中的特異位點結合，抑制CO和FT基因的轉錄，導致AtCDF1轉基因擬南芥開花延遲，然而在長日照條件下，泛素蛋白FKF1（F-BOX 1）與多跨膜結構蛋白GI（GIGANTEA）形成GI-FKF1（GIGANTEA-FLAVINBINDING，KELCH REPEAT，F-BOX1）蛋白復合體，抑制AtCDF1基因的轉錄，將AtCDF1從CO的啟動子區域解除下來，進而促進開花［2，89-91］。AtDof4.1作為一個轉錄抑制因子，延遲擬南芥開花，并且抑制生殖器官發育，葉片、花和角果變小［55］。在水稻中，OsDofs在抽穗期發揮調控作用，存在基因冗余現象［92］；OsDofs參與光周期響應，黑暗抑制OsDof12基因表達，光照誘導表達，在長日照（LDs）條件下，超表達OsDof12顯著降低轉基因水稻開花時間，下游基因Hd3a（Heading date3a）和OsMADS14（MCM1、AGAMOUS、DEFICIENS和SRF14）上調表達，推測OsDof12基因通過直接或間接調節Hd3a和OsMADS14基因的表達，進而改變水稻開花時間［93］。干擾水稻晝夜波動OsRdd1（Rice Dof daily fluctuations 1）基因后，延長干擾植株的開花時間，并且水稻種子顆粒大小和千粒重均顯著減小［2，94］。超表達SlCDF3抑制轉基因擬南芥株系中CO和FT基因的表達，導致轉基因植株開花延遲［83］。CDF1-CDF3、CDF5基因的表達受光周期的調控，在光周期開始時表達量最高，處理16 h-20 h時轉錄水平降為最低值，在黎明時升高［95］。在麻風樹中，JcDof1和JcDof3基因在持續光照條件下，呈現出晝夜振蕩表達模式，并受藍光和紅光的影響，JcDof3可以與F-box發生體外蛋白互作，調節光周期開花［42，96］。在番茄中，SlCDFs基因也參與光周期響應，其中，SlCDF1和SlCDF3在光周期起始階段表達量最高，然而，SlCDF2、SlCDF4和SlCDF5在夜晚表達量達到峰值［83］。在多年生多次開花的楊樹中，PttCDFs基因與擬南芥的AtCDFs具有相似的晝夜振蕩表達模式，在光周期的起始階段表達量最高，由此說明，CDFs基因在擬南芥和楊樹中功能具有保守性［97］。在梨樹中，PbDof9.2基因的表達受光周期和生物鐘的調節，在擬南芥中異源表達PbDof9.2，通過促進PbTFL1a和PbTFL1b基因的轉錄，抑制開花時間調節因子FT的活性，延長轉基因植株的開花時間，表明Dof轉錄因子在植物光周期調控開花中具有功能保守性［36］。在苜蓿中，MtCDFd1_1呈現周期性的晝夜表達模式，在黎明時轉錄水平達到峰值，過表達MtCDFd1_1導致苜蓿在春化條件下開花延遲，在非春化條件下開花時間不受影響，MtCO-like基因的表達沒有變化；長日照誘導基因MtFTa1、MtFTb1、MtFTb2、和MtSOC1a下調表達［98］。Mtfta1和35S：MtCDFd1_1雙重突變體植株的開花時間不晚于Mtfta1，表明35S：MtCDFd1_1可能通過抑制MtFTa1的表達，進而影響春化條件下的開花，MtCDFs在苜蓿光周期下通過冗余的抑制FT-like基因（尤其是MtFTa1）的表達發揮作用，但是以CO獨立的光周期調控方式這與擬南芥中不同［98］。

4 Dof轉錄因子在毛竹中的研究進展

毛竹為禾本科竹亞科剛竹屬散生竹，是竹類植物中分布面積最大，用處最廣，集經濟、生態、社會效益于一體的筍材兩用竹種。Dof轉錄因子在毛竹的非生物脅迫以及開花調控中也發揮重要作用。研究表明，大部分PheDofs參與毛竹干旱、低溫和高鹽的響應［99］，在4℃低溫和250 mmol/L NaCl處理的幼莖中，PheDof4-1誘導表達，而在20% PEG8000的根中轉錄水平顯著下降［39］；GUS染色結果表明，PheDof12-1主要在轉基因擬南芥的根、下胚軸、葉片維管束、雄蕊和花瓣中表達［100］。表達模式結果顯示，PheDofs在毛竹早期花序和盛花期中表達量較高［101］，不同花發育時期轉錄組測序結果顯示，有238個基因與毛竹開花相關，PheDofs基因在毛竹開花過程中成倍上調表達，在毛竹花發育的早期階段高量表達［102］，干旱誘導PheDofs上調表達，促進Hd3a和MADS14基因轉錄，進而促進毛竹開花［103］，推測Dof-Hd3a-MADS14調控通路在毛竹開花途徑中發揮關鍵作用［104］。原位雜交實驗結果顯示，PheDof1在毛竹的頂端分生組織、花序軸、穎片和苞片中表達；免疫印跡試驗表明，PheDof1主要在毛竹花發育的花芽形成期、花序伸長期和盛花期中表達，這表明PheDof1參與毛竹開花［105-106］。在擬南芥中超表達PheDof12-1，導致轉基因植株開花提前，開花誘導因子FT、SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS）、AGL24

（AGAMOUS-LIKE24）上調表達，開花抑制SVP（SHORT VEGETATIVE PHASE）、FLC（FLOWERING LOCUS C）下調表達；PheDofs是節律基因，參與光周期響應，在光周期處理條件下，大部分PheDofs基因在光照的起始階段表達量較高，在黃昏時分表達量較低，酵母單雜交結果顯示，PheDof12-1可以與PheCOL4的啟動子結合［100］。由此表明，PheDofs基因具有功能多樣性和保守性，不僅參與非生物脅迫響應，還參與光周期調控毛竹開花。

5 展望

Dof轉錄因子廣泛參與植物的種子萌發、碳氮代謝、非生物脅迫、開花調控等過程，表明了Dof轉錄因子在植物的生長發育過程中發揮重要作用。到目前為止，Dof轉錄因子的研究主要集中在模式植物和一年生植物中［43］，如擬南芥、水稻、番茄、大豆和玉米等。但是在多年生一次開花的毛竹中的研究少之甚少。該研究領域主要集中在毛竹筍的快速生長及激素調節等方面，在開花調控過程中，僅MADS-box、SOC1和FT基因有少量報道，其他轉錄因子相關報道幾乎為零，并且PheDofs轉錄因子的靶基因尚不明確，與其他轉錄因子或蛋白的相互作用共同調控毛竹開花的分子機制尚不清楚，是否像其他模式植物一樣通過Dof-CO-FT通路調節毛竹開花，還需要進一步研究。因此，在今后的研究中可以利用生物信息學、分子生物學和遺傳學方法，探索Dof轉錄因子調控毛竹開花的下游靶基因及其互作蛋白，這將有助于探索毛竹開花的分子機制，為研究其調控網絡提供新的思路和方法。