蛋氨酸調控畜禽氧化應激的研究進展

劉融 崔凱 白福恒 刁其玉

（1. 蘭州大學草地農業生態系統國家重點實驗室 蘭州大學草地農業科技學院，蘭州 730020；2. 中國農業科學院飼料研究所 農業農村部

飼料生物技術重點實驗室，北京 100081；3. 德州市陵城區白富恒養殖場，德州 250523）

氧化應激（Oxidative stress）是指機體受到外界刺激產生并積累過多自由基所導致的體內氧化還原失衡狀態。在生產中，氧化應激引發腹瀉等動物性疾病、導致幼畜成活率下降，并對畜禽生產水平和畜產品品質造成嚴重影響［1］。畜禽產生氧化應激的主要原因包括機體的生理狀況、日糧營養水平和環境因素等。

營養物質是動物體內自由基產生的物質基礎，也是動物體內清除自由基的物質來源。近年來，關于營養水平與機體健康的研究成為生命科學領域的焦點。2019年，Cell雜志同時發表了3篇文章詳細報道了禁食和嚴重卡路里限制對不同免疫細胞水平和定位及其機制的影響［2-4］。Nature報道密西根大學Ursula Jakob教授團隊關于生命早期的氧化應激會讓線蟲活得更久的最新發現［5］。模式動物日糧中能量和蛋白質攝入限制引起的細胞老化速率降低等現象可能是由蛋氨酸限制引起的ROS產生及氧化損傷的減少導致的［6］。

限制飲食中蛋氨酸可以迅速而有效地改變機體的代謝狀態，尤其是以蛋氨酸為中心的代謝路徑。多項研究證實，蛋氨酸代謝調控炎癥性巨噬細胞活化的免疫代謝，蛋氨酸限制飲食可影響腫瘤的發生和治療。蛋氨酸對于緩解機體氧化應激，提高機體抗氧化能力具有重要影響［7-8］。MetR可以通過減少線粒體活性氧產生、調控Nrf2、ATF4、AP-1等轉錄因子介導的關鍵信號通路以及改變miRNAs表達等方式參與氧化應激的調控，改善氧化狀態并在一定程度上促進機體健康。本文綜述了氧化應激的產生、蛋氨酸調控氧化應激的機制及信號通路，以期為畜牧生產提供理論指導。

1 氧化應激的產生及影響

1.1 氧化應激的產生機理

體內自由基產生過多，超出機體抗氧化系統的清除能力，機體氧化系統和抗氧化系統失衡，造成細胞與機體氧化損傷，即產生了氧化應激。機體自由基主要包括活性氧族（Reactiveoxygenspecies，ROS）和活性氮族（Reactivenitrogenspecies，RNS）。機體內抗氧化系統包括酶類和非酶類，酶類抗氧化系統主要是超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）、輔 酶Q、谷 胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶（Glutathioneperoxidase，GSH-Px）、谷胱甘肽還原酶（GSSG-R）、谷胱甘肽轉移酶（Glutathionetransferase，GST）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）等；非酶類抗氧化系統主要有谷胱甘肽、維生素A、維生素C、維生素E、β-胡蘿卜素、茶多酚等；另外，體內高濃度的游離氨基酸也可作為活性氧的清除劑［9］。以上物質能夠直接清除自由基或通過抵抗自由基發揮作用，進而保護機體免受自由基的傷害。氧化還原狀態的判定是必要的，目前通過檢測機體本身的氧化還原狀態以及組織或血液中的氧化應激代謝產物、抗氧化物質（抗氧化酶和非酶抗氧化劑）可以對機體氧化應激狀態進行綜合判定［10］。

1.2 氧化應激對機體以及畜禽生產的影響

氧化應激會引發細胞內蛋白質、脂類和DNA等細胞大分子的氧化損傷，造成遺傳信息的丟失或改變，也可使細胞膜上不飽和脂肪酸過氧化，改變細胞膜的通透性，破壞細胞穩態［9］。在人類病理學研究中，氧化還原失衡被認為與胰島素抵抗、動脈粥樣硬化、癌癥和神經退行性疾病的病因和進展有關［11］。在畜禽生產中，氧化應激導致幼齡畜禽腹瀉率上升、抗病力下降，成活率降低；降低成年畜禽的生產性能并對畜禽產品品質造成不利影響［1］。斷奶應激過程存在嚴重的氧化應激并伴隨腸屏障功能受損、疾病易感性增加和內分泌失調等問題，Zhu等［12］的研究表明仔豬斷奶應激刺激自由基的產生并抑制抗氧化能力。畜禽飼養中的營養及理化環境等因素均是氧化應激的誘因，溫雅俐［13］的研究表明，熱應激可降低奶牛采食量和營養物質的消化率，降低產奶量。馬燕芬等［14］的研究表明，熱應激破壞奶山羊瘤胃上皮組織結構，導致瘤胃黏膜屏障通透性增加，降低其生理機能和生產性能。

2 蛋氨酸對氧化應激的影響

蛋氨酸是一種含硫必需氨基酸，是琥珀酰輔酶A、同型半胱氨酸、半胱氨酸、肌酸和肉堿的前體。蛋氨酸具有重要的生理功能，研究表明蛋氨酸除了作為蛋白質合成過程中的起始氨基酸參與機體蛋白質的合成外，還可以影響哺乳動物的先天免疫系統和消化功能，并干預脂質代謝、內源性抗氧化酶（如甲硫氨酸亞砜還原酶A）的激活以及谷胱甘肽的生物合成以對抗氧化應激［15］。

適量添加蛋氨酸可改善畜禽氧化應激狀態，仔豬飼喂高水平含硫氨基酸（SAA）（0.85%），總抗氧化能力，超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性增加［16］。李亮［7］的研究表明，蛋氨酸能夠顯著提高雉雞血清及肝臟抗氧化能力。蛋氨酸過量添加導致蛋氨酸中毒，危害動物健康導致生產性能的降低［17］。模式動物研究結果多反映出MetR對氧化應激的正面效應，MetR后的高脂日糧小鼠肝臟與血漿中T-AOC和GSH-Px活力顯著增加，丙二醛和ROS含量極顯著降低，血脂和肝臟脂肪積累也顯著降低［8］。雖然MetR可產生如減少內臟脂肪、增加胰島素敏感性和改善脂質代謝等多種有益的生理效應［18］，但MetR日糧會降低體重增長速率，所以很明顯，MetR對大型家畜的生產意義不大。王杰［19］的研究表明，相對于蛋氨酸正常添加組，蛋氨酸限制組末重顯著降低，料重比顯著增加。MetR 顯著降低羔羊血清SOD活性，下調羔羊肝臟組織α型谷胱甘肽轉移酶（GSTA）、μ谷胱甘肽轉移酶（GSTM）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化相關基因的表達水平。Castellano等［20］的研究表明，日糧蛋氨酸缺乏時生長豬肝臟GSH含量的降低和脂肪組織抗氧化酶活性的增加共同改變了細胞氧化還原狀態，該實驗中，不同組織的抗氧化酶活性變化趨勢并不一致。目前，蛋氨酸對機體氧化應激的影響的研究并未取得一致結果，處理效果與添加劑量以及動物種類密切相關，仍需進一步研究。

3 MetR調控氧化應激的分子機制

MetR對細胞氧化應激的調控是多種機制共同作用的結果，其中主要機制有兩種：MetR可減少線粒體中ROS（mtROS）的產生從而降低細胞氧化應激狀態；MetR作用于信號通路調控肝臟組織抗氧化基因的表達，從而調控細胞氧化還原狀態。

3.1 MetR對線粒體ROS產生的影響

線粒體電子傳遞鏈由復合體 I、II、III、IV四個主要的氧化還原復合體酶系組成，其功能是進行生物氧化，并與磷酸化相偶聯，共同產生ATP。電子在傳遞給末端氧化酶之前漏出呼吸鏈與氧反應生成超氧自由基的過程是線粒體生成活性氧的源頭。Chance［21］的報道指出，正常生理狀態線粒體活性氧的產生量相當于其耗氧的1%-2%，活性氧會導致脂質、蛋白質及線粒體DNA（mtDNA）等細胞大分子損傷。研究表明，活性氧在線粒體復合物 Ⅰ 和復合物 Ⅲ 中產生［22］，位于親水性復合物 Ⅰ 結構域中的硫鐵簇等結構，或位于復合物I的內膜臂中的泛醌是導致復合物I ROS生成的主要電子輸運組分；復合物 Ⅲ 的Q0位點的半醌自由基（UQH·）可能是O2生成O2

-·的單電子供體［23］。

大量研究表明，MetR性日糧可以降低線粒體活性氧的產生率，從而降低線粒體氧化損傷［6，24-27］。飼喂80% MetR日糧的大鼠肝臟、心臟線粒體的活性氧生成減少，特別是復合物I產生的活性氧，mtDNA氧化損傷標記物（8-oxodg）濃度降低，線粒體糖氧化損傷標記物（CEL和CML）、脂質氧化損傷標記物（MDAL和CML）、蛋白質氧化損傷標記物（GSA和AASA）含量降低［6，24］。飼喂40% MetR日糧7周后大鼠的心臟、肝臟、腦和腎臟組織以及30%MetR下仔豬的肝臟線粒體也獲得了類似的結果［24-26］（表1）。在上述研究中，活性氧生成的減少并不是氧通量降低引起的，因為活性氧生成的減少時氧氣消耗量往往是不變或者增加的［6，24-26］。線粒體復合物濃度和活力的下降以及線粒體自由基泄露百分比的減少是MetR降低線粒體ROS的產生從而降低氧化損傷的主要原因。另外，部分研究顯示線粒體凋亡誘導因子（Apoptosis-inducing factor，AIF）的蛋白質豐度降低［26］，但它的變化存在組織特異性［25］。

另外，MetR下模式動物壽命的延長支持線粒體自由基老化理論，許多研究結果認為，長壽物種中存在較低的mtROS產生，對內源性抗氧化劑或蛋白質和DNA修復系統的需求也較小，這樣有效降低了能量消耗［22］。研究表明MetR日糧下，線粒體中MnSOD含量不變［22-23］。對此研究者認為，線粒體氧化應激的減少是mtROS產生減少而不是抗氧化酶的增加。MetR作用于線粒體的機制有待于進一步的研究。

3.2 MetR調控氧化應激相關的信號通路

MetR導致蛋氨酸代謝途徑發生改變，其中轉硫途徑的改變導致肝臟GSH含量下降［28］，GSH濃度的降低可能作為信號分子調控基因表達。在氧化應激通路中Nrf2、ATF4和AP-1/c-Jun是重要的氧化還原反應轉錄因子［29］。

3.2.1 核因子NF-E2相關因子（Nrf2） Nrf2-ARE通路是最廣泛的抗氧化應激通路之一，是體內最大的抗氧化應激體系。Nrf2是細胞抗氧化反應重要的調控因子，細胞在氧化應激和親電子物的過量攻擊時能夠引起Nrf2/Keap1復合物解聚，游離的Nrf2迅速進入細胞核，與小Maf等堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）蛋白形成異二聚體與靶基因中抗氧化應答原件（Antioxidant response element，ARE）序列結合，ARE位于半胱氨酸連接酶催化亞基（Glutamate cysteineligasecatalyticsubunit，GCLC）、血紅素氧合酶1（HO-1）和NAD（P）H醌氧化還原酶1（NQO1）以及α和π型谷胱甘肽轉移酶（α-GST；GST-π）等許多解毒和抗氧化酶基因的啟動子區域［11］。Nrf2與ARE結合可增強抗氧化酶系統相關基因的表達，發揮抗氧化作用，重建細胞氧化還原穩態。研究表明，MAPKs、PI3K/Akt和蛋白激酶C均可在氧化應激下被激活［30］。通過檢測MAPK家族中胞外信號調節激酶（ERK）、絲裂原激活蛋白激酶（p38）和c-Jun氨基端激酶（JNK）等轉錄調節因子的磷酸化水平以及RNA干擾等手段，證實在小鼠肝臟原代細胞中，MetR通過激活ERK參與GST的表達調控［31］。

表1 MetR對動物線粒體氧化應激相關參數變化

二相解毒酶GST（包括A3/5、M1和P1）在肝臟組織中的誘導作用在喂食蛋白質缺乏日糧或蛋氨酸缺乏日糧的大鼠中得到報道［11］。Tsai等［32］的研究表明，GSTP基因在大鼠原代肝細胞中的表達由含硫氨基酸限制特異性誘導上調，而不是通過亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸或賴氨酸的限制。Lin等［11］的研究發現，MetR通過ERK-Nrf2-GPEI信號通路上調GSTP基因轉錄。小鼠對MetR日糧肝轉錄組學反應的分析表明，蛋氨酸限制性日糧對肝臟轉錄組的影響主要集中在對肝臟促炎信號轉錄的下調，以及抗氧化反應上調。肝臟中促炎通路基因表達的減少可能是NFE2l2基因的激活驅動抗氧化反應的結果［33］。

3.2.2 活 化 轉 錄 因 子4（ATF-4） ATF-4是 一 種bZIP轉錄因子，由缺氧、內質網應激、氨基酸剝奪和氧化應激等應激信號誘導的，ATF4 與 CCAAT增強子結合蛋白（CCAAT /enhancer-binding protein，C/EBP）形成二聚體，與 C/EBP 激活轉錄因子應答元件（C/EBPactivating transcription factor response elements，CARE）結合，參與調控氧化應激、氨基酸合代謝、脂質代謝、自噬和血管生成等相關基因的表達［34］。

Kilberg等［35］綜述了調控ATF4表達的幾種途徑，其中MetR可通過PERK/eIF2α/ATF4和GCN2/eIF2α/ATF4通路誘導 ATF4的表達。一般性調控阻遏蛋白 激 酶2（General control nonderepressible 2kinase，GCN2）是氨基酸缺乏的感受器，在維持機體氨基酸平衡相關的信號通路的調節過程中發揮著重要作用，在限制必需氨基酸的細胞外供應或阻斷其它非必需氨基酸的合成所誘導的氨基酸反應（AAR）中被激活。幾乎每種氨基酸（包括蛋氨酸）氨基酸限制時，細胞內空載tRNA增多，激活GCN2，從而引起 eIF2α 的磷酸化，上調ATF-4的表達［36］。除GCN2外PERK也參與eIF2α 的磷酸化和翻譯控制過程［37］。由理化刺激引發的內質網應激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）會觸發未折疊蛋白反應（Unfolded protein response，UPR）的多條通路，其中包括激活eIF2α的激酶PERK，eIF2α的磷酸化可上調ATF4的合成和下游轉錄程序。GCN2或PERK的營養傳感參與蛋氨酸限制期間對蛋白質平衡長期控制機制，但也有研究表明它們對MetR期間的代謝適應是不必要的［18］。

eIF2α的激酶PERK通常在內質網應激條件被激活，但也有研究指出，在沒有內質網應激的情況下，MetR也 可 激 活PERK并 通 過PERK向eIF2α/ATF4和Nrf2傳遞信號。MetR的結果是通過eIF2α/ATF4激活綜合應激反應（ISR）并激活Nrf2敏感抗氧化反應程序［37］。上述機制對MetR誘導的整體應激反應（ISR）具有重要意義，它有助于調節細胞內穩態和生理反應實現MetR期間的代謝適應（圖1）。

圖1 MetR調控Nrf2、ATF-4信號通路

3.2.3 激活蛋白1（AP-1）及其他轉錄因子 AP-1/c-Jun作為許多細胞內信號級聯的靶點，這些級聯被細胞外信號分子（如細胞因子、生長因子和激素）或各種物理化學應激源激活。AP-1與細胞增殖、程序性死亡的調節和應激反應有關［38］。研究發現，L-半胱氨酸和/或L-蛋氨酸供應不足降低細胞GSH含量，并激活氧化還原敏感轉錄因子，包括Nrf2、AP-1和NF-kb［39］。

Tsai等［32］研究表明，限制L-蛋氨酸可能通過GSH耗竭從而激活ERK-AP-1信號通路，AP-1與GSTP增強子I（GPE I）的5'上游區域的TPA反應元件（TPAResponse Element，TRE）結合，上調GSTP基因的表達。

AP-1/c-Jun和ATF4除了單獨參與細胞應激下的反應，還可與Nrf2共同作用于氧化還原反應。Nrf2與其他bZIP成員形成二聚體，參與ARE的激活，除了與小Maf蛋白結合外，bZIP蛋白c-Jun（AP-1轉錄因子的主要成分）和ATF4也可能與Nrf2二聚［29］。Venugopal 和Jaiswal［40-41］的研究表明，c-Jun是Nrf2激活ARE依賴性轉錄的結合伙伴，而Fos家族的成員是抑制因子。He等［42］的研究表明，ATF4可協同 Nrf2 調控ARE依賴性的Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的表達。

3.3 MetR改變小RNA（miRNAs）表達

蛋氨酸水平除了影響DNA 甲基化這種非常普遍的基因表達調控方式，還可能通過調節miRNAs實現營養表觀遺傳學調控。miRNAs屬于短鏈非編碼RNA，在動物體內通常參與轉錄后基因沉默的調節作用。氧化應激可以改變許多miRNAs的表達水平，但是這些變化如何與氧化應激反應相關卻知之甚少。

Engedal等［43］研究發現13種miRNA在人類細胞中受到氧化應激的調節：let-7f、miR-9、miR-16、miR-21、miR-22、miR-29b、miR-99a、miR-125b、miR-128、miR-143、miR-144、miR-155和miR-200c。利用數據庫及軟件預測了以上miRNA的共同基因靶點和25條共同的細胞通路，并利用功能分析得出miRNA的靶基因主要作用于（蛋白）泛素化途徑。

研究表明，miRNAs受蛋氨酸可用性的調節，并可能在代謝中發揮作用［44-45］。攝入MetR日糧（0.12%）的小鼠骨髓中的miR-133a，miR-335-5p和miR-204表達增加，血漿和肝臟中的miR-31表達增加［46］。虹鱒魚攝入MetR日糧（0.775%）4周，骨骼肌中的miR-133a水平較低［47］。研究者認為，miRNAs在細胞應激反應中起著不可或缺的作用，通過調節miRNAs的數量、miRNAs靶點的數量或miRNAs蛋白復合物的活性等方式介導應激反應，恢復或合成新的體內平衡［48］。

4 結語

蛋氨酸作為必需氨基酸，是動物生長發育不可以缺少的營養素。大量研究證實，蛋氨酸的供給水平與機體氧化應激狀態和健康水平息息相關。線粒體結構和功能的變化、Nrf2、ATF4、AP-1等轉錄因子介導的信號通路的激活以及miRNAs的改變在MetR下氧化還原狀態的調控中起關鍵作用。MetR下線粒體以及信號通路的變化機制的探索對氨基酸營養調控具有重要的理論價值，同時對畜禽健康養殖有重要實際意義。