σ Factor SigW/Anti-σ Factor RsiW參與東湖假單胞菌HYS對秀麗隱桿線蟲毒性作用

伍婷婷 桂哲 秦迎秋 謝志雄

（武漢大學生命科學學院，武漢 430072）

本實驗室前期分離得到一株革蘭氏陰性菌，通過生理生化檢測和全基因組測序分析，將該菌株命名為Pseudomonas donghuensisHYST［1］。研究發(fā)現東湖假單胞菌HYS菌株與常用于宿主感染研究的條件致病菌銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1、PA14菌株相比，其能更顯著地縮短秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）的壽命，具更強的毒性，這表明東湖假單胞菌HYS中可能存在較為特殊的致病或毒性機制［1-3］。從構建的東湖假單胞菌HYS轉座子插入突變庫中通過初篩復篩和基因定位后獲得一株可能是反σ因子基因位點插入突變株［4］。

假單胞菌中可選擇性的σ因子是最重要和常見的調控機制之一［5］。假單胞菌為響應胞外的信號，含有可選擇性的σ因子σECF（胞外功能σ因子）的RNA聚合酶則可以起始轉錄特定基因。例如，毒性基因或毒性相關基因的表達，銅綠假單胞菌中大多數σECF介導的信號通路一般都會與跨膜蛋白反σ因子形成σECF/反σ因子系統，兩者共同調節(jié)σECF依賴型基因的表達［6-9］。

本研究從已獲得的轉座子突變株來探討東湖假單胞菌HYS中的SigW/RsiW（σ因子/反σ因子）參與其對秀麗隱桿線蟲的毒性及其可能的調控機制，旨為深入解析假單胞菌致病性調控機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 線蟲、菌株、質粒 秀麗隱桿線蟲購買于

CaenorhabditisGenetics Center（CGC）；Pseudomonas donghuensisHYS實驗室保存；Escherichia coliS17-1實驗室保存；Escherichia coliOP50（簡稱OP50）實驗室保存。Saccharomyces cerevisiaePJ69-4A、S.cerevisiaePJ69-4α來源于高向東教授贈予。質粒pBBR1-MCS2（簡稱pBBR2）、pEX18Gm實驗室保存。質粒pGAD、pGBDU來源于高向東教授贈予。

1.1.2 引物 本研究中所用引物均由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成，如表1所示。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基，NGM培養(yǎng)基［1］。YPD培養(yǎng)基，SC-Ura固體培養(yǎng)基，SC-Leu固體培養(yǎng)基，SC-Ura-Leu-His固體培養(yǎng)基，SC-Ura-Leu-His-Ade固體培養(yǎng)基，SC-Ura-Leu-His+3-AT固體培養(yǎng)基［10］。

1.2 方法

1.2.1 生物信息分析工具 東湖假單胞菌HYS的核酸以及蛋白序列下載自NCBI網站（CP019396.1，WP_010226811.1，WP_010226809.1）。脫氧核苷酸及蛋白質序列比對：NCBI網站。蛋白跨膜預測：http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/。

1.2.2 HYS基因組提取 采用BioMIGA細菌基因組提取試劑盒提取細菌基因組，具體的操作方法參照試劑盒中革蘭氏陰性菌的說明書。

1.2.3 菌株對秀麗隱桿線蟲的致死作用 配制NGM固體平板，向5個NGM固體平板分別滴加200 r/min振蕩過夜培養(yǎng)12 h的200 μL菌液，每個NGM固體菌苔放入20條秀麗隱桿線蟲成蟲，每種菌株共100條，每隔24 h計數平板中蟲子的死活數量，直至全部死亡，其中以Escherichia coliOP50為陽性對照，P. donghuensisHYS為陰性對照，利用SPSS 18.0軟件的Kaplan-Meier繪制線蟲生存函數曲線，對于非正常死亡的秀麗隱桿線蟲記為“censored“，根據SPSS 18.0軟件得到的LT50具體數值由origin 9.0軟件繪制LT50點狀圖。

1.2.4 東湖假單胞菌HYS基因敲除方法 設計引物擴增待敲除基因在基因組前后的各約500 bp左右的序列為上下游同源臂片段，分別與敲除載體pEX18Gm連 接，轉 化 至Escherichia coliS17-1。E.coliS17-1中的質粒通過細菌接合導入東湖假單胞菌HYS，與HYS基因組發(fā)生同源重組，通過PCR檢測與基因測序最終確定目標基因是否敲除。

1.2.5 酵母雙雜交 將要檢測相互作用的蛋白對應的DNA片段擴增，與含AD蛋白的質粒pGAD或含BD蛋白的質粒pGBDU分別連接，分別轉化至酵母菌pJ69-4A和pJ69-4α。將帶有不同質粒的酵母菌pJ69-4A和pJ69-4α兩種菌株分別兩兩混合，選擇攜帶有兩種質粒的二倍體細胞并分別影印到篩選平板上，恒溫培養(yǎng)并觀察是否有菌苔長出，其中在平板SC-Ura-Leu-His生長代表兩蛋白互作弱，在平板SCUra-Leu-His + 5 mmol/L 3-AT生長代表兩蛋白互作中等強度，在平板SC-Ura-Leu-His-Ade生長代表兩蛋白互作強。

1.2.6 RNA提取及反轉錄PCR Trizol法提取RNA，用日本TaKaRa公司的試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）將已經提取的總RNA中殘留的基因組去除并進行反轉錄PCR。

1.2.7 熒光定量 采用日本TaKaRa公司的試劑盒（SYBR Premix Ex TaqTMII），在儀器Bio-Rad熒光定

量PCR儀三步法PCR擴增，最后用分析軟件Bio-Rad分析基因表達量，本實驗中將野生型HYS菌株中目的基因的表達量始終設置為1，用參照基因rpoB作為標準進行相對定量。

表1 本研究中所用引物

2 結果

2.1 基因rsiW參與東湖假單胞菌HYS對秀麗隱桿線蟲的毒性

編號為0201 7A的HYS插入突變株喂食秀麗隱桿線蟲的LT50為4.739±0.190 d，比野生型HYS能夠延長LT50約2 d（圖1）。轉座子在基因組上插入的位置及生信預測結果如表2和圖2所示，0201 7A中插入失活的基因為rsiW，編碼反σ因子。

表2 東湖假單胞菌HYS轉座子插入突變株

為確定rsiW是否參與HYS菌株毒性，構建ΔrsiW敲除菌株及回補菌株并測定喂食秀麗隱桿線蟲后的生存函數。結果發(fā)現，喂食ΔrsiW的秀麗隱桿線蟲LT50為5.053±0.143 d，與0201 7A突變株一致（圖3）。喂食菌株ΔrsiW（pBBR2-rsiW）的秀麗隱桿線蟲LT50為3.748±0.078 d，與喂食菌株HYS（pBBR2）的秀麗隱桿線蟲LT50基本一致，說明ΔrsiW的缺失突變得到恢復，證實東湖假單胞菌HYS菌株中基因rsiW參與了其對秀麗隱桿線蟲的毒性（圖3）。

2.2 與反σ因子RsiW作用的σ因子確定

在HYS基因組中基因rsiW前面有一個注釋為RNA polymerase subunit sigma-24（σ24）的蛋白基因，RsiW為跨膜蛋白，氨基酸序列83-102是跨膜區(qū)域，1-82是膜內N端，103-249是膜外C端（圖4），由經典的σ因子/反σ因子系統特征初步推測σ24和RsiW是一對σ因子/反σ因子。

為確定σ24和RsiW是否是一對σ因子/反σ因子，分別將σ24以及RsiW的膜內外片段構建酵母雙雜交相關菌株，將構建成功的任意兩種不同菌株混合影印到不同的固體培養(yǎng)基上。在SC-Ura-Leu-His、SCUra-Leu-His + 5 mmol/L 3-AT和SC-Ura-Leu-His-Ade培養(yǎng)基上的有菌苔生長情況（圖5），顯示反σ因子RsiW與σ24存在蛋白互作，且RsiW通過RsiW-N與σ24互作，這說明σ24是其對應的SigW。

圖1 東湖假單胞菌HYS轉座子插入突變株喂食秀麗隱桿線蟲的生存函數（A）和半致死時間LT50（B）

圖2 0201 7A菌株基因插入位點蛋白比對

圖3 東湖假單胞菌ΔrsiW敲除菌株及回補菌株喂食秀麗隱桿線蟲的生存函數（A）和半致死時間LT50（B）

圖4 RsiW與RNA polymerase subunit sigma-24（σ24）跨膜預測

2.3 sigW參與東湖假單胞菌HYS對秀麗隱桿線蟲毒性

為確定SigW是否參與HYS菌株對秀麗隱桿線蟲毒性，構建其敲除菌株及回補菌株并測定喂食秀麗隱桿線蟲后的生存函數。喂食ΔsigW的秀麗隱桿線蟲LT50為3.728±0.103 d，但喂食ΔsigW（pBBR2-sigW）和HYS（pBBR2-sigW）的LT50分別為5.011±0.228 d和4.656±0.191 d，相對野生型HYS菌株延長約2 d，具有減毒現象（圖6-A-B）。熒光定量PCR檢測減毒菌株ΔsigW（pBBR2-sigW）和HYS（pBBR2-sigW）中sigW的表達量顯著增加，增幅高于rsiW（圖6-C）。

與野生型HYS相比，喂食ΔsigW-rsiW的秀麗隱 桿 線 蟲LT50為3.335±0.082 d，但 喂 食ΔsigWrsiW（pBBR2-sigW）的LT50為5.820±0.182 d，相對野生型HYS能夠延長LT50約2 d，具有減毒現象（圖7-A-B）。熒光定量PCR減毒菌株ΔsigW-rsiW（pBBR2-sigW）中僅sigW高表達量（圖7-C）。以上結果說明基因sigW參與東湖假單胞菌HYS對秀麗隱桿線蟲的毒性，且存在一定的劑量效應。

3 討論

本研究從轉座子插入突變庫中篩選出反σ因子RsiW參與東湖假單胞菌HYS對秀麗隱桿線蟲的毒性，通過生物信息學分析，酵母雙雜交等實驗鑒定出與RsiW發(fā)生蛋白互作的σ因子SigW，初步確定東湖假單胞菌HYS中存在SigW/RsiW（σ因子/反σ因子），且參與東湖假單胞菌HYS對秀麗隱桿線蟲的毒性。假單胞菌毒性方面有關σ因子/反σ因子系統的研究顯示，在銅綠假單胞菌中主要發(fā)現AlgU/MucA（σ因子/反σ因子）與其致病性緊密相關［11］，而在枯草芽胞桿菌168中報道較詳細的是SigW/RsiW（σ因子/反σ因子）相互作用，并沒有發(fā)現其與毒性有相關性［11-15］，因此在假單胞菌中SigW/RsiW（σ因子/反σ因子）與毒性有關是一個新的發(fā)現。

圖5 RsiW與SigW酵母雙雜交

圖6 東湖假單胞菌ΔsigW敲除菌株及回補菌株喂食秀麗隱桿線蟲的生存函數（A）、半致死時間LT50（B）及熒光定量結果（C）

圖7 東湖假單胞菌HYSΔsigW-rsiW敲除菌株及回補菌株喂食秀麗隱桿線蟲的生存函數（A）、半致死時間LT50（B）及熒光定量結果（C）

研究發(fā)現大多數假單胞菌反σ因子是單程跨膜蛋白，作為信號傳導的傳感器。C端胞外周質域為傳感器域，響應周質或外膜中產生的信號；N端胞質域為反σ結構域（ASD），傳遞信號至對應的σ因子處，約為80-90個氨基酸［7］。在枯草芽胞桿菌中，RsiW通過膜內N端與對應的SigW發(fā)生互作［16-17］。HYS菌株的酵母雙雜交結果顯示RsiW-C不能夠與SigW發(fā)生互作，而RsiW-N和RsiW能夠與SigW發(fā)生互作，推測HYS菌株RsiW的胞內N端可能是將C端感應的信號跨膜傳到SigW，參與胞外信號響應從而參與毒性。

銅綠假單胞菌中σ因子/反σ因子系統若缺少誘導刺激，反σ因子對σ因子有抑制作用，核心RNA聚合酶不能與σ因子結合，導致下游相關基因不能表達，若過表達σ因子或者給相應的誘導刺激，σ因子亦可調控σ因子依賴型基因的表達［17-20］。一般情況下若假單胞菌中毒性相關σ因子失活，σ因子不能調控相關基因的表達，從而減少假單胞菌的毒性，但是也存在σ因子失活時，假單胞菌的毒性增強的情況［9，21］。本研究結果顯示，ΔsigW和ΔsigW-rsiW喂 食 秀 麗 隱 桿 線 蟲 的LT50時間與野生型HYS菌株的基本一致，而sigW表達相對rsiW較強時可存在減毒效應，這說明SigW通過RsiW互作參與東湖假單胞菌HYS對秀麗隱桿線蟲毒性作用且存在一定的劑量效應，即在東湖假單胞菌HYS菌株中SigW沒有被RsiW抑制時，SigW依賴型基因表現出對線蟲的減毒效應，但具體是哪些途徑基因表達受SigW影響及調控機制，尚需進一步深入探討。

東湖假單胞菌HYS對模式生物秀麗隱桿線蟲具有強烈的毒性，作為潛在的生物致病菌株，其毒性機理目前尚不明確，本研究的可選擇的σ因子SigW為探討東湖假單胞菌HYS菌株中毒力因子調控機制奠定基礎，也為未來東湖假單胞菌HYS可能引起的動物感染治療提供思路。

4 結論

本研究發(fā)現東湖假單胞菌HYS存在SigW/RsiW（σ因子/反σ因子），該系統參與秀麗隱桿線蟲的毒性，且存在一定的劑量效應，該發(fā)現為深入理解假單胞菌致病機制提供了新線索。