四環素降解菌共培養體系構建及廢水修復的群落分析

吳學玲 周翔宇 吳曉燕 羅奎 顧怡超 周晗 廖婉晴 曾偉民

（1. 中南大學資源加工與生物工程學院，長沙 410083；2. 中南大學生物冶金教育部重點實驗室，長沙 410083）

中國是當前世界第一大抗生素生產國和使用國，其中畜牧業的抗生素使用量占全球使用量的30%［1］。在畜牧業普遍應用的抗生素中，四環素類抗生素是一大類具有廣譜適應性的抗生素，包括四環素、土霉素和金霉素等。四環素可以治療動物疾病，同時在畜禽和水產養殖業中還可以作為飼料的添加劑來促進動物的生長，但由于四環素在動物體內有30%-90%的成分無法被代謝吸收，將直接以母體化合物的形式排出體外［2-3］。根據已知報道，環境中的四環素殘留已在我國諸多流域被發現。如Chen等［4］發現湘江流域長株潭段的四環素濃度為3.12 ng/L，Wang等［5］發現長江重慶段四環素含量為8.38 ng/L，Selvam等［6］則報道發現香港周邊水體中四環素含量達到497 ng/L。當前環境中普遍存在的四環素可能造成環境中原始菌群的破壞、抗性基因的傳播與潛在的耐藥性問題。在我們過去的研究中，利用高效降解菌對四環素污染的土壤進行了修復。研究發現引入高效降解菌可有效降低土壤中四環素的濃度，群落結構也會由于四環素濃度變化、引入菌株的微生物間相互作用等因素而發生改變。同時，引入高效降解菌還會引起土壤中四環素抗性基因及可移動基因元件的含量下降，這表明土壤修復過程中高效降解菌的引入沒有導致抗性基因的傳播。上述研究對于抗生素污染的微生物修復有很重要的意義［7］。正因如此，本研究進一步關注到了微生物對于含四環素廢水的生物修復。

用微生物進行四環素的生物降解具有極大的應用價值，且綠色安全。針對當前廢水中的四環素污染，研究人員充分利用四環素本身特性，提出了包括水解、臭氧處理、紫外照射等在內的多種處理方式。盡管這些方式降低了殘留四環素的濃度，但其處理后產生的四環素降解產物可能會具有更大的生物毒性。在這一背景下，不難發現微生物降解四環素具有綠色環保、易于控制、操作簡便、生態毒性低等諸多優點。而從環境中發現越來越多的微生物顯示了降解四環素的能力，如Leng等［8］發現的菌株Stenotrophomonas maltophiliaDT1、Shao等［9］分離獲得的Klebsiellasp.SQY5等。對這些菌株都進行了四環素相關降解能力的檢測，且通過LC-MS對這些微生物降解四環素所產生的物質進行了分析發現，產物的生物毒性較母體化合物更低。

此外，現有的許多研究表明，與單一菌株相比，微生物共培養方式能夠通過菌株間的相互作用，對污染物的去除產生更好的效果。如蘇宏南等［10］采用地衣芽孢桿菌B-1與放線菌K-1構成的共培養體系對β-氯氰菊酯進行去除，其效果比單獨施用菌株B-1效果要高出15%左右。Li等［11］比較了小球藻、米曲霉和雙菌株共培養對含砷廢水的處理效果。結果表明，共培養可獲得最高的砷去除率（93%）。Seo等［12］采用一株不能分解萘的菌株AcinetobacteroleivoransDR1與 降 解 菌Pseudomonassp.AS1進 行共培養時，菌株AS1代謝產生的水楊酸可作為菌株DR1的碳源，而菌株DR1產生的胞外多糖則對菌株AS1的生物膜形成有明顯促進作用。但這些菌株多用于實驗室研究，很少有報道提出這些菌株應用于廢水實際生物修復可能造成的影響。高通量測序技術的應用打破了傳統研究方法的局限性，使研究人員能夠對四環素降解菌在生物修復過程前后，微生物的組成和結構變化進行更加深入的研究。

目前對四環素降解菌原位修復的群落研究雖然還在初步探索階段，但已有研究表明，原位修復過程微生物群落結構的組成在一定程度上會受到棲息地環境、海拔高度和季節差異等因素在內的許多條件的影響。而采用高通量技術來進行不同環境因素下微生物群落結構表征，可以更好的分析包括生物修復在內的四環素遷移對細菌群落的影響。如Milakovi?等［13］分析了含有一定量抗生素的工業廢水對于河流沉積物及群落的影響，揭示了包括tetC在內的四環素抗性基因在環境中的傳播與耐藥菌間的相關關系；Liu等［14］通過高通量測序發現，添加物造成的影響大于土壤中四環素濃度變化的影響揭示了生物炭吸附土壤中四環素造成的群落變化；與之類似的，Peng等［15］采用電化學方式進行了四環素廢水修復發現，在引入外來電流情況下，誘導Thauera作為主要的芳香化合物降解菌，在群落中起到了主要作用。而我們前期研究中，同樣采用該共培養體系進行了土壤中四環素生物修復實驗，群落變化顯示引入的高效微生物后造成了群落中Proteobacteria的顯著提高［7］。但是，當前明確采用共培養微生物系統進行四環素廢水生物修復的群落研究報道較少。

本研究在前期研究的基礎上，利用兩株四環素高效降解菌Raoultellasp.XY-1和Pandoraeasp.XY-2組成了共培養體系，并進一步采用高通量測序技術對四環素廢水生物修復前后細菌群落組成進行了分析。通過比較高效四環素降解菌介入生物修復過程前后的群落變化，在一定程度上揭示了生物修復后可能造成的微生態影響，旨在為加快研究人員對高效降解微生物資源的潛力開發，以及實際工程應用和環境的可持續發展提供更多的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 四環素高效降解菌XY-1與XY-2分離自湖南省長沙市望城區黃金園村某養豬場沉積池廢水與底泥中，經過NCBI數據庫16S rRNA比對，分別為Raoultellasp.及Pandoraeasp.，目前保存在中南大學生物冶金教育部重點實驗室。

1.1.2 藥品 四環素標準品（C22H24N2O8·HCl），購于上海源葉生物科技有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（Na2-EDTA）（分析純）、磷酸二氫鈉（分析純）、檸檬酸（分析純）；甲醇（色譜純）；乙腈（色譜純）。群落DNA提取試劑盒為DNeay Powersoil Kit（50）試劑盒。

1.1.3 培養基 葡萄糖培養基：葡萄糖 10 g/L，氯化鈉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母浸膏5 g/L。

1.1.4 廢水來源 本研究在前期獲得高效四環素降解菌的養豬場相同池體中采樣獲得。

1.2 方法

1.2.1 平板對峙實驗 在直徑為9 cm的葡萄糖培養平板中心接種菌株Raoultellasp. XY-1（d =7 mm），距中心1 .5 cm處劃線接種菌株Pandoraeasp. XY-2，每個菌株重復 3 次，以劃線接種無菌培養液替代Pandoraeasp. XY-2菌液做為對照，培養48 h時觀察有無抑菌帶并做記錄。兩菌株間的拮抗性用抑菌距離來表示：抑菌距離=對照組菌株XY-1半徑-試驗組菌株XY-1半徑。

1.2.2 降解菌共培養體系構建 將四環素標準品以無菌水溶解制成四環素標準溶液，并采用0.22 μm濾膜過濾除菌。將菌株Raoultellasp.XY-1與Pandoraeasp.XY-2分別在葡萄糖培養基中培養至對數生長期，在無菌條件下，以4℃、8 000 r/min條件下離心10 min收集菌體，采用無菌生理鹽水重懸，調節OD=1.0± 0.05。向培養基中加入現配的四環素標準溶液至初始四環素濃度為80 mg/L，以2%（V：V）濃度向培養基中接入微生物，在30℃、150 r/min條件下進行暗培養。本研究共設置4組實驗：（1）無菌對照；（2）只添加菌株XY-1；（3）只添加菌株XY-2；（4）菌株XY-1及XY-2各1%進行共培養。每組實驗在相同條件下設置三平行，每隔24 h進行取樣。

1.2.3 共培養菌株混合比例優化 將事先準備好的菌株Raoultellasp.XY-1與Pandoraeasp.XY-2懸 液分別按照3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶3的比例進行混合。將混合好的菌液以2%（V∶V）濃度向培養基中接入微生物，在30℃、150 r/min條件下進行暗培養。每種比例設置3個平行樣本，培養12d時檢測各樣本四環素含量變化。

1.2.4 共培養體系對含四環素廢水的生物修復 本研究中將原始廢水樣本作為空白。將取得的廢水混勻后，分別向實驗組與對照組的5 L錐形瓶中添加3 L廢水，實驗組與對照組皆包含3個平行樣本。向實驗組添加5%共培養微生物（V∶V），對照組在相同條件下添加滅菌后的共培養微生物。在室溫條件下每7 d測定水體中的四環素含量濃度，并以血球計數板計算水體中的微生物含量，當微生物總量低于1×108CFU/mL時，補充微生物使總量達到1×108CFU/mL以上。

1.2.5 培養基及廢水理化參數 對廢水中CODCr、pH、NH4+-N、總氮、硝態氮及重金屬離子濃度等基本參數進行測定。其中COD采用重鉻酸鉀法進行測定；pH采用pH計測定；NH4+-N采用納氏試劑分光光度法進行檢測；總氮采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法進行檢測；硝態氮采用紫外分光光度法進行測量；重金屬離子濃度采用ICP-MES進行測定。四環素采用高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）進行檢測。將待測樣品在8 000 r/min離心15 min，取4 mL上清液加入等體積的Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖液用以鰲合金屬離子。向溶液中加入1 mL正己烷及1 mL三氯甲烷用以萃取脫脂。所有溶液充分振蕩2 min混合均勻后超聲30 s，然后8 000 r/min離心15 min，用0.22 μm微孔濾膜過濾，密封于4℃冷藏。所有樣品在360 nm紫外線條件下進行檢測，進樣量為20 μm。采用色譜柱為TC-C18（2）反相色譜柱（150 ×4.6 mm，Agilent Technologies），柱溫箱設置條件為30℃。流動相由NaH2PO4和乙腈組成，以0.5 mL/min的梯度洗脫模式運行，其比例隨時間變化（0-5 min，85%∶15%（V/V）；6-12 min，55%:45%（V/V）；12-16 min，85%∶15%（V/V）。

HPLC檢測四環素標準品的的相對保留時間為12.97 min，以四環素的濃度梯度為橫坐標，相對應的峰面積為縱坐標，進行相關性分析后得到四環素回歸方程為y=94.161x-327.38，R2=0.995 5。采用空白培養基檢測四環素在10、40 mg/L兩個濃度下的回收檢測結果見表1。在此兩濃度下的平均回收率分別為88.14%和87.75%，變異系數分別為0.95%及1.61%，其測量精密度的相對標準偏差小于5%，該方法用于樣品中四環素殘留量的定量分析是穩定、有效、可行的。

表1 四環素回收率情況

1.2.6 生物修復的細菌群落多樣性 分別收集實驗組與對照組反應前后的廢水，樣本采用0.22 μm 微孔濾膜過濾后，以無菌磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）洗脫菌體。洗脫液在4℃、8 000 r/min條件下離心15 min，收集沉淀。所有沉淀采用DNeay Powersoil Kit（50）試劑盒提取群落細菌DNA。所有樣品選擇16S rRNA 基因高變區序列進行測序，采用測序引物為338F-806R，V3-V4區為測序區域，將相同組的平行樣本測序結果合并進行后續分析。

圖1 葡萄糖培養基中四環素殘留濃度變化（A）和共培養體系比例優化（B）

2 結果

2.1 共培養體系的構建

根據平板對峙實驗，該兩株菌株所形成抑菌圈寬度分別為2.32 mm、1.35 mm和2.30 mm，都普遍低于5 mm，我們認為該兩株菌株沒有明顯拮抗作用，可以較好的進行共培養。當培養基濃度中四環素濃度在80 mg/L時，四環素高效降解菌對于四環素具有良好的降解效果，在6 d后均能達到50%以上的去除率。在反應前期單菌株與共培養系統對于四環素的降解無顯著差異，前4 d菌株Raoultellasp.XY-1、Pandoraeasp. XY-2與共培養系統降解率分別為32.68%、37.28%和37.48%。但單菌株在8 d時四環素降解率已達到平臺期，分別為71.28%與65.32%，此后單菌株對四環素降解率均無明顯提升。共培養系統相較于單菌株作用時長更持久，在8 d后還存在持續降解的情況，在10 d時降解率達到73.94%，與單菌株最高降解情況大致相當。此后，12 d時共培養系統降解率達到80%以上。且我們針對0 d和12 d的樣本進行了顯著差異分析，結果如表2所示。根據結果，在0 d樣本間無顯著差異，而12 d樣本間有顯著差異，說明樣本設置可靠，共培養體系優勢明顯（圖1）。

表2 不同時間樣本顯著差異分析

根據共培養體系菌株比例優化，當菌株Raoultellasp. XY-1與Pandoraeasp. XY-2接 種 比 例為1∶1時，四環素降解率最高達到84.41%；其次是按照2∶1接種達到的80.39及3∶1接種達到的78.8%。因此，我們選擇菌株初始接種比例為1∶1作為后續共培養系統的最佳比例。

2.2 含四環素廢水的生物修復

經過數據監測，該廢水處理前及微生物處理后基本參數變化如表3所示。將共培養微生物投入廢水中后，經過60 d的共培養微生物處理，其四環素濃度由3.34 mg/L降低至1.03 mg/L，CODCr由462.16 mg/L降低至224.65 mg/L。且包括砷、銅、鋅在內的多種重金屬含量有顯著降低情況。此外，我們發現水體pH由6.82向堿性條件發展，這說明四環素在整體修復過程中處于類堿水解的修復方式。

2.3 生物修復過程的群落分析

廢水中提取的群落DNA經過測序，合并實驗組與對照組樣本共得到206 176個有效序列，總長度為87 239 680 bp，片段平均長度為422.762 4 bp。隨后本研究采用97%閾值對細菌群落進行聚類判定與物種注釋，共計得到9 040個OTU，32門，60綱，457屬，646種。同時，本研究通過Shannon指數估算微生物多樣性；Chao1指數估算微生物豐度（圖2）來完成了α分析。結果顯示，實驗組與對照組原始樣本在多樣性和種群豐度具有良好的一致性；當共培養菌株Raoultellasp.XY-1及Pandoraeasp.XY-2大量介入修復過程時，群落整體多樣性與豐度降低。

經過β多樣性分析顯示，從Veen圖（圖3-A）中，我們可以明確得知實驗組樣本、對照組樣本與原始兩組樣本間共有97個相同屬，處理前的實驗組與對照組間共有140個共有屬，處理后的實驗組與對照組間共有121個相同的屬。

廢水中群落在修復后有顯著變化。從綱水平菌群結構來看（圖3-B），對照組中芽孢桿菌綱（Bacilli）較修復之前明顯增多，而擬桿菌綱（Bacterodia）與γ變形菌綱（Gammaproteobacteria）豐度明顯下降。與之有顯著差異的，γ變形菌綱（Gammaproteobacteria）豐度在添加了共培養微生物的實驗組中有明顯提高，這是由于共培養菌株都屬于γ變形菌綱的緣故。

表3 生物修復中理化參數變化情況

圖2 實驗組與對照組修復前后群落香濃指數分析（A）及實驗組與對照組修復前后群落Chao指數分析（B）

本研究進一步在屬水平上進行了種群結構分析，結果如圖3-C所示。處理后的樣品中，對照組的優勢屬依次為Bacillus（39.72%）、Lysinibacillus（12.08%）、Chujaibacter（7.34%）、Nitrospira（4.24%）、Acidipila（4.17%）、Castellaniella（2.72%）、Phaeodactylibacter（1.97%）、norank-fnorank-o-OPB56（1.61%）、norank-f-Chitinophagaceae（1.43%）、Rhodanobacter（1.42%）；實驗組的優勢屬為Raoultella（19.97%）、Rhodanobacter（12.66%）、Comamonas（12.09%）、unclassified-f-Chitinophagaceae（5.77%）、Moheibacter（5.11%）、Truepera（4.95%）、Thermomonas（4.92%）、Castellaniella（4.85%）、norank-f-NS9-marine-group（4.46%）和unclassified-o-Flavobacteriales（3.23%）。其中包括的共有優勢屬為Castellaniella與Rhodanobacter。此外，本研究將對照組、實驗組和修復后的實驗組與對照組進行了組內顯著差異分析，結果如圖4所示。分析發現，一部分菌屬經過修復，在對照組和實驗組都出現了下降趨勢（norank-f-Chitinophagaceae、Moheibacter、Thauera、Arenimonas和norank-f-Bacteroidetes-vadinHA17）；還有一部分菌株在對照組內呈下降趨勢，在實驗組卻呈現上升趨勢（Comamonas、Truepera、unclassified-f-Chitinophagaceae、Rhodanobacter）。而有意思的是，修復后的實驗組與對照組中有顯著差異趨勢的菌屬都與對照組或實驗組顯著差異表現了一致，包括Rhodanobacter、Comamonas、unclassified-f-Chitinophagaceae、Moheibacter、Truepera和norank-f-Chitinophagaceae。

3 討論

四環素在環境中的遷移、轉化、降解所造成的危害日益顯著，人體耐藥性問題、抗性基因的廣泛傳播都被廣泛關注，采用微生物進行廢水中的四環素降解是當前較為經濟和實用的一種方式。而明確的采用多種微生物進行聯合修復必然是未來的一種發展趨勢，較之單菌株具有更廣泛的實用意義。

本研究中共培養系統采用的高效四環素降解菌XY-1及XY-2分別為潘多拉屬菌株及植生拉烏爾菌屬菌株［16-17］。潘多拉菌屬最早是在2000年被發現，截至今天，該屬中共有10個種被命名提出。在已報道的潘多拉菌屬菌株中，已多次證實了其對抗生素的耐受性，并對于多種污染物降解都有一定的潛力。如Qi等［18］采用宏基因組分析手段，確定了潘多拉菌屬具有利用酸性中間體參與微生物協同降解四氫呋喃的能力。Liu等［19］采用一株Pandoraeasp. B-6成功進行了木質素的分解。Yang等［20］利用土壤中存在的潘多拉菌，進行與四環素同樣含有多苯環結構的鄰苯二甲酸二丁酯的降解，其降解率在3 d可以達到92%。2001年，由Olson等學者提出成立了拉烏爾菌屬。之前已報道的菌株主要包括植生拉烏爾菌、解鳥氨酸拉烏爾菌和土生拉烏爾菌3個種屬，研究人員發現該屬菌株具有含苯環有機物的能力。在已知的研究中，采用拉烏爾菌屬菌株進行的包括芳香烴、菊酯類農藥［21］、氯甲苯［22］在內的降解都能取得較好的效果。此外，拉烏爾菌屬對四環素的降解能力也已有研究人員進行了探究，在該屬菌株中發現了具有四環素抗性基因tet39［23］。我們之前的研究發現菌株Raoultellasp. XY-1具有tet（D）及tet（E）兩個四環素抗性基因，這在一定程度上解釋了該菌株能進行四環素降解的原因。

本研究通過生物修復發現，廢水中諸多污染物都有明顯減少。微生物能以水體中的有機物作為營養物質提供自身所需，廢水中COD的減少必然是微生物代謝發揮了主要作用。添加共培養微生物的水體，pH向堿性變化明顯，這與在土壤研究中的表現一致［7］。Leng等［24］采用模擬廢水進行的研究也有相同的表現，其認為水體變堿性是由于微生物代謝分解了培養基中的蛋白胨等物質，產生了氨和銨等代謝產物造成的。當pH升高后，四環素水解進一步加強。廢水中pH升高的主因是微生物造成的，由此本研究認為除對照組自然水解外，其余所有四環素的降解都可歸因于共培養微生物的作用。根據已知研究，在堿性條件下，微生物對四環素的去除沒有明顯減少，但所產生的四環素抗性基因會受到抑制［25］，這也進一步表明我們的研究可能不會引起環境中四環素抗性基因的傳播。這對于四環素污染的微生物修復及減少環境中四環素抗性基因的存在具有重要意義。

同時，我們根據前期研究分析發現，包括Cu2+、Fe3+和Zn2+在內的主要金屬離子是影響四環素去除的一大因素。一方面，細菌在抗生素及金屬離子的脅迫下，會產生胞外多聚物用以保護自身生長繁殖［17］。由于胞外多聚物具有的吸附作用，可以將重金屬吸附在細菌上，進而使得廢水中的金屬物質有所降低［26］。另一方面，已有的研究說明，金屬離子可以與四環素形成金屬鰲合物，在水體中長期存在。當金屬離子含量降低時，水體中的四環素更容易被微生物降解，而四環素與金屬形成的鰲合物也可以通過菌體吸附減少［27］。這也說明，當實驗后期不再補充共培養菌株，而四環素持續減少，這可能是由于失活的菌體與鰲合物發生了吸附。

本研究還采用高通量測序技術，對共培養菌株在廢水生物修復過程發生的細菌群落變化進行了檢測。結果發現群落豐度與多樣性在生物修復后都有所降低，我們推測這是由于在四環素降解過程中，不能耐受四環素及其降解產物的敏感型菌株大量死亡造成的。而處理后的廢水中，對照組與實驗組的共有優勢菌屬為Castellaniella與Rhodanobacter，我們判斷這兩個菌屬與廢水中四環素修復有一定聯系。在已知的研究中，Wang等［28］采用分離的兩個高效降解菌群進行四環素去除，其Chao指數同樣顯著降低，這與本研究結果一致，且Castellaniella同樣在四環素減少后成為了優勢菌屬。

根據實驗組與對照組修復前后群落顯著差異分析，一部分菌屬顯示了明顯差異。在這些菌屬中，一部分菌屬被發現具有降解有機物的能力，如Moheibacter通常發現于禽畜糞便中，與四環素類抗生素及糞便中有機物分解有相關關系［29-30］；Comamonas能進行苯環化合物降解［31］；Arenimonas則同樣可進行含有苯環結構的酚類、醌類有機物的降解［32］。而另一方面，這些菌屬中還有一部分具有與氮循環有關的能力，如Comamonas、Arenimonas及Thauera能進行反硝化［33-35］。通過反硝化，減少了水體中NO3--N的存在，這與我們的檢測結果相符合，也在一定程度上解釋了廢水的生物修復過程出現了pH向堿性發展的原因。有研究發現Truepera、Rhodanobacter［36-37］具有環境中氮循環以及在低溫下降解氨氮的能力。這些菌株對廢水中其余有機物降解均具有極大潛力。

此外，本研究中實驗組Raoultella菌屬顯著增多，而未發現Pandoraea菌屬，這是由于真實廢水的生境比實驗室搖瓶的最優條件復雜。同時，盡管菌株來源地相同，但分離菌株的廢水與本次修復的廢水已不是同一批次，受到了季節、水體理化參數等不同條件的限制。本研究中引入的Raoultellasp.XY-1能大量繁殖，并成為優勢菌屬之一，可能是四環素被成功去除的一大因素。

4 結論

本實驗利用兩株高效四環素降解菌株Raoultellasp.XY-1及Pandoraeasp. XY-2構建的共培養系統進行了四環素降解實驗，研究發現在80 mg/L的四環素濃度條件下，當共培養體系初始接種比例為1∶1時，12日去除率最佳達到84.41%。

采用共培養系統進行了四環素廢水的生物修復，60 d時廢水中四環素濃度由3.342 78 mg/L降低至1.032 05 mg/L，COD濃度由462.16 mg/L降低至224.65 mg/L，去除率分別達到70%和50%左右。

采用高通量測序檢測了廢水修復前后的群落結構變化，結果說明修復后群落多樣性顯著降低。引入的共培養系統中的Raoultellasp. XY-1在群落中成為優勢菌株，是四環素去除的主因之一。