人CSE 蛋白的結(jié)構(gòu)與功能分析

袁小燕,王 燁,劉艷萍,雷媛娣,張朝暉

(南華大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，湖南 衡陽，421001)

硫化氫(H2S)是第三個(gè)氣體信號(hào)分子。大量研究表明，H2S參與心血管重構(gòu)、細(xì)胞增殖、遷移和侵襲、氧化應(yīng)激和炎癥等生物學(xué)過程[1-3]。內(nèi)源性H2S主要由L-半胱氨酸經(jīng)胱硫醚-β-合成酶(Cystathionine-β-synthase,CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(Cystathionine-γ-lyase,CSE)和3-巰基-丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3-MST)[4-5]三種酶催化生成。而肺組織內(nèi)源性硫化氫主要由胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)在細(xì)胞漿里以L-半胱氨酸為底物催化產(chǎn)生[6]。有研究報(bào)道用H2S進(jìn)行預(yù)處理可以減輕氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的肺損傷[7]，當(dāng)暴露于煙草煙霧時(shí)缺乏CSE的小鼠表現(xiàn)出氣道阻塞、氣道高反應(yīng)性和肺部炎癥等疾病[8]。也有研究證實(shí)增加大鼠CSE表達(dá)和H2S生成可促進(jìn)機(jī)體抗氧化、抗炎作用的發(fā)揮進(jìn)而減輕移植性肺損傷[9]。本研究同樣表明H2S對(duì)大鼠肺組織急性損傷具有保護(hù)作用[10]。許多證據(jù)表明CSE/H2S體系廣泛參與了細(xì)胞的生物過程，通過調(diào)控CSE的表達(dá)從而增加肺部H2S生成有可能減輕或治愈慢性肺部疾病。

鑒于CSE蛋白的重要功能，且對(duì)于CSE蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究尚不完善。利用生物信息學(xué)方法對(duì)人CSE蛋白進(jìn)行理化性質(zhì),結(jié)構(gòu)及功能分析，為深入研究CSE的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 人CSE蛋白序列

在美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫( https: / / www．ncbi．nlm．nih．gov /)中以“cystathionine-γ-lyase+物種名”為關(guān)鍵詞，搜索并下載人CSE蛋白的氨基酸序列( NCBI：CTH序列號(hào): NP_001177392.1Gene ID:1 491)。

1.2 人CSE蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測

使用在線工具ExPASy-ProtParam Tool (https://web.expasy.org/protparam/)對(duì)人CSE蛋白的分子式、等電點(diǎn),酸堿性和穩(wěn)定性等理化性質(zhì)進(jìn)行分析；利用Protscale (https://web.expasy.org/protscale/)對(duì)人CSE 蛋白進(jìn)行疏親水性分析；使用TMHMM Serverv2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線分析人CSE蛋白跨膜結(jié)構(gòu)；使用SignalP-4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)在線預(yù)測人CSE蛋白有無信號(hào)肽及切割位點(diǎn)。

1.3 人CSE蛋白的結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

利用NCBI CDD (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/domains-structures/)在線預(yù)測人CSE蛋白結(jié)構(gòu)域;使用PSORT II Prediction(https://www.genscript.com/psort.html)及Gene card(https://www.genecards.org/)在線預(yù)測人CSE蛋白亞細(xì)胞定位；利用Netphos3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)和Scansite 4.0 (https://scansite4.mit.edu/4.0/#home)在線預(yù)測人CSE蛋白磷酸化位點(diǎn)。

1.4 人CSE蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及高級(jí)結(jié)構(gòu)分析

用ExPAsy-GOR IV4.0在線工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)和PredictProtein(https://www.predictprotein.org/)預(yù)測人CSE蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)構(gòu)建人CSE蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.5 人CSE蛋白的相互作用蛋白預(yù)測

使用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，設(shè)置為高置信度0.7，不限制數(shù)量，在線預(yù)測人CSE蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 人CSE蛋白理化性質(zhì)結(jié)果分析

經(jīng)ExPASy-ProtParam Tool 預(yù)測發(fā)現(xiàn)：人CSE 蛋白由 373個(gè)氨基酸組成，位于人類1號(hào)染色體，分子質(zhì)量為41 260.23 ku，理論等電點(diǎn)為6.38，負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)為39個(gè)，正電荷氨基酸殘基數(shù)為34個(gè)，分子式為C1 839H2 883N501O542S18，原子總數(shù)為5 783個(gè)，不穩(wěn)定系數(shù)為35.0(<40)屬于穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為87.32，總平均親水系數(shù)為-0.160。

2.2 人CSE蛋白親水/疏水區(qū)域結(jié)果分析

經(jīng)Protscale預(yù)測發(fā)現(xiàn)：人CSE蛋白親水性最強(qiáng)的位點(diǎn)為第31位的谷氨酰胺，分值為-2.5；疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)是第191位的脯氨酸和第192位的甘氨酸，分值為1.978，親水性值總和大于疏水性值總和(見表1)，由圖1可知，CSE序列中親水區(qū)域多于疏水區(qū)域，據(jù)此推斷CSE蛋白屬于親水性蛋白，這與理化性質(zhì)分析結(jié)果一致。

2.3 人CSE蛋白跨膜結(jié)構(gòu)結(jié)果分析

經(jīng)TMHMM預(yù)測發(fā)現(xiàn)人CSE蛋白位于膜外(見圖2粉色細(xì)線)的概率幾乎為100%，位于膜內(nèi)(見圖2藍(lán)色細(xì)線)和跨膜區(qū)域(見圖2紅色細(xì)線)的概率幾乎為0。粉色粗線代表多肽鏈中跨膜區(qū)域所在位置，因CSE蛋白沒有跨膜區(qū)域，所以不顯示相應(yīng)標(biāo)記，據(jù)此推斷人CSE蛋白不屬于跨膜蛋白。

表1 人CSE 蛋白親水性與疏水性氨基酸殘基預(yù)測Table 1 Hydrophilic and hydrophobic amino acid residue prediction of human CSE protein

圖1 人 CSE 蛋白親水性/疏水性預(yù)測Fig.1 Hydrophilic / hydrophobic prediction of human CSE protein

圖2 人CSE 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Transmembrane domains analysis of human CSE protein

2.4 人CSE蛋白信號(hào)肽切割位點(diǎn)結(jié)果分析

經(jīng)SignalP-4.1(cut-off值設(shè)置為0.45)預(yù)測發(fā)現(xiàn)：人CSE蛋白無信號(hào)肽序列，屬于非分泌蛋白。原始切割位點(diǎn)C值在第23位氨基酸，分值為0.124；被結(jié)合的剪切點(diǎn)Y值最高點(diǎn)在第23位氨基酸，分值為0.117；信號(hào)肽S值最高點(diǎn)位于第3位氨基酸，分值為0.140；位于1-22位氨基酸序列的平均信號(hào)肽分值為0.111，D值為0.114，不足以形成信號(hào)肽區(qū)域(見表2和圖3)。

表2 人CSE蛋白信號(hào)肽切割位點(diǎn)預(yù)測Table 2 Signal peptide cleavage site prediction of human CSE protein

圖3 人CSE 蛋白信號(hào)肽預(yù)測Fig.3 Signal Peptide prediction of human CSE protein

2.5 人CSE蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用ExPAsy-GOR IV4.0和PredictProtein兩種工具預(yù)測人CSE蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，并繪制結(jié)構(gòu)模型。經(jīng)GOR預(yù)測發(fā)現(xiàn)人CSE蛋白一共有373個(gè)氨基酸，該序列主要含有Alpha helix螺旋，Extended strand延伸鏈和Random coil無規(guī)則卷曲，其中α螺旋(見圖4藍(lán)色)有112個(gè)氨基酸，占30.03%，β折疊(見圖4紅色)有71個(gè)氨基酸，占19.03%，無規(guī)則卷曲(見圖4紫色)有190個(gè)氨基酸，占50.94%。

經(jīng)PredictProtein預(yù)測發(fā)現(xiàn)CSE蛋白序列中α螺旋占38.87%，β折疊占16.62%，無規(guī)則卷曲占44.50%。ExPAsy-GOR IV4.0和PredictProtein預(yù)測結(jié)果比對(duì)表明，兩種預(yù)測工具所預(yù)測的結(jié)果基本吻合，都表明CSE蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主。

在圖4中，上部：示意圖；下圖：高峰數(shù)字。藍(lán)色：α螺旋；紅色：β折疊；紫色：無規(guī)則卷曲。

圖4 人CSE蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Secondary structure analysis of human CSE protein

2.6 人CSE蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)果分析

經(jīng)NCBI CDD預(yù)測發(fā)現(xiàn)人CSE蛋白在19-347位氨基酸處含有保守結(jié)構(gòu)域，屬于PLP(磷酸吡哆醛)依賴性酶家族，該家族包括參與半胱氨酸和蛋氨酸代謝的酶并且都以PLP作為輔助因子(見圖5)。

2.7 人CSE蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果分析

利用PSORT II Prediction和Gene card兩種軟件預(yù)測人CSE蛋白亞細(xì)胞定位，經(jīng)PSORT預(yù)測發(fā)現(xiàn)CSE蛋白有52.2%可能存在于細(xì)胞質(zhì)，有30.4%可能存在于細(xì)胞核，有17.4%可能存在于線粒體，說明CSE蛋白位于細(xì)胞質(zhì)的可能性最大，Gene card預(yù)測發(fā)現(xiàn)CSE蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的得分最高 (見圖6)兩種軟件的亞細(xì)胞定位結(jié)果相一致，據(jù)此推斷CSE蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)中。

圖5 人CSE 蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.5 Conserved domains prediction of human CSE protein

圖6 人CSE 蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測Fig.6 Subcellular localization prediction of human CSE protein

2.8 人CSE蛋白磷酸化位點(diǎn)結(jié)果分析

利用Netphos3.1和Scansite 4.0 兩種軟件預(yù)測人CSE蛋白磷酸化位點(diǎn)。

經(jīng)Netphos3.1預(yù)測發(fā)現(xiàn)CSE蛋白質(zhì)有15個(gè)絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)，13個(gè)蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)及5個(gè)酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)(見圖7)。

經(jīng)Scansite 4.0預(yù)測發(fā)現(xiàn)CSE蛋白質(zhì)有29個(gè)絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)，21個(gè)蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)和9個(gè)酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)。兩種軟件都表明CSE蛋白含有絲氨酸磷酸化位點(diǎn)最多。

圖7 人CSE蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測Fig.7 Phosphorylation sites prediction of human CSE protein

2.9 人CSE蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用SWISS-MODEL預(yù)測人CSE蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，GMQE為0.97，QMEAN為-0.54，序列與BLAST數(shù)據(jù)庫中5tsu.1模板序列相似性高達(dá)99.19%，表明該模型結(jié)構(gòu)合理，該蛋白質(zhì)存在較多扭曲，結(jié)構(gòu)較豐富，這對(duì)其生物學(xué)功能具有重要作用(見圖8)。

圖8 人CSE蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.8 Tertiary structure prediction of human CSE protein

2.10 人CSE蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

使用STRING預(yù)測人CSE蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置為高置信度0.7，限制數(shù)量10個(gè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)人CSE蛋白與DLD、TST、CBSL、TXNRD1等蛋白質(zhì)具有相互作用(見圖9)。對(duì)以上互作蛋白的基因進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析，GO分析結(jié)果表明互作基因主要參與輔因子結(jié)合、維生素結(jié)合和催化活化等分子功能(見表3)涉及硫氨基酸代謝過程、硫氨基酸生物合成、α-氨基酸生物合成、細(xì)胞氨基酸代謝等生物過程(見表4)。KEGG通路分析結(jié)果顯示，互作基因顯著富集于半胱氨酸與蛋氨酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、氨基酸生物合成、硒化合物代謝等通路中(見表5)。

圖9 人CSE蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測Fig.9 Protein-protein interaction network predictionof human CSE protein

表3 GO分子功能分類結(jié)果Table 3 GO molecular function results

表5 KEGG pathway 路徑列表Table 5 KEGG pathway lists

3 討 論

胱硫醚-γ-裂合酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)是轉(zhuǎn)硫途徑的最后一個(gè)關(guān)鍵酶，參與硫化氫(H2S)和谷胱甘肽(GSH)的生成，調(diào)節(jié)氧化還原平衡，是重要的抗氧化分子[11]，然而CSE表達(dá)異常調(diào)節(jié)氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡可以引起慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘[12]以及急性肺損傷[13]等疾病。因此對(duì)于CSE蛋白功能的研究非常重要。本研究基于生物信息學(xué)方法，分析人CSE蛋白的結(jié)構(gòu)和分子功能，結(jié)果顯示：人CSE蛋白位于人類1號(hào)染色體上的短臂上。含有373個(gè)氨基酸，是穩(wěn)定的親水性蛋白，不具有跨膜結(jié)構(gòu)，無信號(hào)肽屬于非分泌性蛋白，蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)的可能性大提示該蛋白質(zhì)可能主要在細(xì)胞質(zhì)發(fā)揮生物學(xué)作用。具有大量的絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)和較少的酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)、蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主推測無規(guī)則卷曲是CSE蛋白主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)原件。結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)人CSE蛋白屬于PLP依賴性酶的異亞家族，CSE是由兩個(gè)二聚體組成的四聚體，每個(gè)單體都有三個(gè)獨(dú)立的域：(I)較大的N-末端結(jié)構(gòu)域，它是活性二聚體內(nèi)相鄰單體的活性位點(diǎn)的一部分、(II)攜帶大多數(shù)催化重要?dú)埢腜LP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和(III)C-末端結(jié)構(gòu)域[14]。每個(gè)單體共價(jià)結(jié)合一個(gè)PLP輔助因子，通過Schiff堿與活性位點(diǎn)賴氨酸結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[15]。

蛋白質(zhì)的磷酸化會(huì)影響蛋白質(zhì)的活性，從而使其執(zhí)行不同的生理功能。本研究發(fā)現(xiàn)人CSE蛋白含有33個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中Ser/Thr位點(diǎn)較多，推測絲氨酸/蘇氨酸最有可能參與其蛋白質(zhì)磷酸化。有研究表明PKC通過絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)底物磷酸化可以轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)并在細(xì)胞信號(hào)作用下調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、代謝、凋亡、分化、增殖和遷移運(yùn)動(dòng)[16-17]。CSE是一種硫轉(zhuǎn)移酶，在活性位點(diǎn)具有活性半胱氨酸殘基，負(fù)責(zé)穩(wěn)定酶的結(jié)構(gòu)及其功能。有研究證實(shí)Ser77突變會(huì)減弱組成四聚體結(jié)構(gòu)的兩個(gè)二聚體之間的相互作用而影響該酶的穩(wěn)定性[18]，也有研究報(bào)導(dǎo)CSE Ser磷酸化可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞H2S的快速釋放從而發(fā)揮心血管保護(hù)作用[19]和維持心肺平衡[20]，因此推測CSE的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化是誘導(dǎo)細(xì)胞迅速產(chǎn)生H2S減輕氧化應(yīng)激的關(guān)鍵點(diǎn)。

通過對(duì)人CSE蛋白的GO分析和KEGG分析可知互作基因主要參與輔因子結(jié)合和催化活化等分子功能涉及氨基酸代謝等生物過程，顯著富集于半胱氨酸與蛋氨酸代謝等通路中。因此，CSE與互作蛋白中的TST、TXNRD1之間的關(guān)系值得探討。CSE、TST和MST在L-半胱氨酸的厭氧、脫硫和代謝中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)TXNRD1(硫氧還蛋白還原酶1)是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞內(nèi)RON水平控制的重要組成部分[21]。TST(硫代硫酸鹽轉(zhuǎn)移酶)是一種單結(jié)構(gòu)域胞質(zhì)硫轉(zhuǎn)移酶，也被認(rèn)為在硫代硫酸鹽氧化合成谷胱甘肽過硫化物的過程中起一定作用，在不利生理?xiàng)l件下，例如硫缺乏或存在過氧化物時(shí)，TST表達(dá)增加發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[22]并在線粒體基質(zhì)中進(jìn)行后續(xù)加工[23]在硫代謝、鐵硫簇形成[24-25]等多種途徑中發(fā)揮作用。包括CSE在內(nèi)的硫轉(zhuǎn)移酶可以在活性氧含量增加的情況下局部防止-SH基團(tuán)的可逆氧化，并可調(diào)節(jié)體內(nèi)GSH水平來平衡氧化還原狀態(tài)維持鈣穩(wěn)態(tài)[26]。由此說明CSE蛋白與相互作用蛋白的作用及參與的硫代謝途徑具有一定的研究價(jià)值，有助于闡明CSE蛋白的作用機(jī)制和生理功能。

通過生物信息學(xué)方法對(duì)人CSE蛋白進(jìn)行預(yù)測和分析，對(duì)明確CSE作用的分子機(jī)制具有參考意義。