大鼠顱腦損傷后差異表達(dá)基因及miRNA研究

王家昕，王曉霞，李 潔，苗澤遠(yuǎn)，倪 爽，王子鈺，蘇立寧

(河北北方學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 張家口 075000)

創(chuàng)傷性腦損傷(Traumaitc brain injury, TBI)是外科常見的疾患，嚴(yán)重影響人們健康和正常生活，致死和致殘率極高。TBI發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，相關(guān)文獻(xiàn)表明，TBI是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，需要多分子參與及相互作用。因此我們利用多種現(xiàn)代生物學(xué)手段及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法，得到大鼠顱腦損傷后基因及miRNA表達(dá)差異，為臨床診斷及治療TBI提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 篩選差異表達(dá)基因

在基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus)搜索并下載基因表達(dá)譜GSE111452和miRNA表達(dá)譜GSE59646，利用GEO2R篩選關(guān)于大鼠腦損傷24 h后基因和miRNA的差異表達(dá)數(shù)據(jù)(P值及FDR值均≤0.05)，再利用MiRwalk軟件對(duì)篩選miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，將靶基因與差異基因進(jìn)行比較，保留重疊的差異表達(dá)基因(Differentially expressed genes，DEGenes)。

1.2 DAVID做差異表達(dá)基因的本體論功能富集分析

DAVID做基因本體論功能富集分析，從生物學(xué)過(guò)程(Biological process，BP)、細(xì)胞成分(Cell components，CC)及分子功能(Molecular function，MF)方面，對(duì)這些基因的功能進(jìn)行描述。篩選標(biāo)準(zhǔn)為P≤0.05。

1.3 Cytoscape軟件構(gòu)建miRNA-DEGenes網(wǎng)絡(luò)圖

利用Excel軟件得出關(guān)于篩選出的miRNA和差異表達(dá)基因的上調(diào)和下調(diào)結(jié)果(根據(jù)logFC值得出上調(diào)和下調(diào)結(jié)果)，并將其結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件生成miRNA-DEGenes網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠腦組織基因及miRNA表達(dá)變化

用GEO2R篩選關(guān)于大鼠腦損傷24小時(shí)后基因和miRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)(P值及FDR值均≤0.05)，得到247個(gè)相對(duì)明顯的差異表達(dá)的基因，包括150個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和97個(gè)下調(diào)表達(dá)基因；7個(gè)差異表達(dá)的miRNA，包括2個(gè)上調(diào)表達(dá)miRNA和5個(gè)下調(diào)表達(dá)miRNA。將差異基因與靶基因?qū)Ρ群螅傻玫?8個(gè)重疊基因。

2.2 差異表達(dá)基因的本體論功能富集分析

在DAVID軟件中進(jìn)行基因的本體論功能富集分析GO發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因中，NES、CCL2、PLIN2、 LGALS1等13個(gè)基因在藥物應(yīng)答(Response to drug)的生物學(xué)進(jìn)程中起作用，CXCL1、CALCA、S1PR3等12 個(gè)基因在炎癥反應(yīng)(Inflammatory response)的生物學(xué)過(guò)程中起作用，CXCL1、 CCL2、RELT等10個(gè)基因在對(duì)脂多糖的反應(yīng)(Response to lipopolysaccharide)中發(fā)揮作用。根據(jù)P值大小，BP富集結(jié)果前20名P值對(duì)數(shù)大小結(jié)果(見圖1)。

圖1 差異表達(dá)基因GO功能富集-生物學(xué)過(guò)程BP結(jié)果Fig.1 Biological process results of GO function enrichment of differentially expressed genes

差異表達(dá)基因在細(xì)胞質(zhì)(Cytoplasm)、胞外外體(Extracellular exosome)、細(xì)胞外間隙(Extracellular-space)等處發(fā)揮作用。根據(jù)P值大小，CC富集結(jié)果前20名P值對(duì)數(shù)大小(見圖2)。

圖2 差異表達(dá)基因GO功能富集-細(xì)胞成分CC結(jié)果Fig.2 Cell components results of GO function enrichment of differentially expressed genes

差異表達(dá)基因在鈣離子結(jié)合(Calcium ion binding)、鈣黏蛋白結(jié)合參與細(xì)胞間粘附(Cadherin binding involved in cell-cell adhesion)、蛋白域特異性結(jié)合 (Protein domain specific binding)等分子功能中起作用。根據(jù)P值大小，MF富集結(jié)果前20名P值對(duì)數(shù)大小(見圖3)。

圖3 差異表達(dá)基因GO功能富-分子功能MF結(jié)果Fig.3 Molecular function results of GO function enrichment of differentially expressed genes

2.3 重疊基因及其對(duì)應(yīng)的miRNA

在上述分析中，將靶基因與差異基因比較得到48個(gè)重疊基因，包括14個(gè)下調(diào)基因以及34個(gè)上調(diào)基因。為了更直觀清楚地看到重疊基因與其對(duì)應(yīng)的miRNA的關(guān)系，將重疊基因、miRNA及其上下調(diào)結(jié)果導(dǎo)入cytoscape軟件，得到miRNA-DEGenes網(wǎng)絡(luò)圖(見圖4)。

3 討 論

20世紀(jì)80年代以來(lái)，隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展及人類急救意識(shí)的增高，各項(xiàng)急救指南的不斷健全與完善，大大提高了創(chuàng)傷性腦損傷的救治水平和救治成功率。現(xiàn)階段，對(duì)于創(chuàng)傷性腦損傷的發(fā)病機(jī)制及病理生理的研究逐漸成熟起來(lái)[1]。

3.1 創(chuàng)傷性腦損傷與炎癥反應(yīng)有著密切聯(lián)系

研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷性腦損傷破壞了血腦屏障，從而導(dǎo)致了炎癥反應(yīng)的發(fā)生。在差異表達(dá)基因GO功能富集-生物學(xué)過(guò)程BP分析結(jié)果中，趨化因子CCL和CXCL基因高表達(dá)，如CCL2、CXCL1、CXCL13等基因。趨化因子是細(xì)胞分泌的微細(xì)胞因子或信號(hào)蛋白，它們被稱為趨化因子，因?yàn)樗鼈兛梢哉T導(dǎo)鄰近反應(yīng)性細(xì)胞的趨化。研究表明，趨化因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)。腦組織在創(chuàng)傷性腦損傷后發(fā)生缺血缺氧，導(dǎo)致部分趨化因子表達(dá)上調(diào)，如單核細(xì)胞趨化因子- l(Monocyte chemoattractant protein, MCP- I )/CCL2、單核細(xì)胞趨化因子-2(Monocyte chemoattractant protein，MCP-2)/CCL8、巨噬細(xì)胞炎性因子-1α(Macrophage inflammatory protein，MIP-1α)/CCL3、白介素-8(Interleukin，IL-8)/CXCL8(分泌趨化因子的細(xì)胞有受損的神經(jīng)元細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形角質(zhì)細(xì)胞等)[2]。這些趨化因子的高表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)了炎癥反應(yīng)的發(fā)展。隨著血腦屏障的進(jìn)一步破壞，血液循環(huán)中的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞進(jìn)入破壞的腦組織。多個(gè)臨床試驗(yàn)表明，炎癥反應(yīng)的發(fā)展與腦損傷后繼發(fā)的局部神經(jīng)組織變性壞死、腦血流自身調(diào)節(jié)功能的改變、血腦屏障通透性改變及血管性和細(xì)胞毒性腦水腫的發(fā)生、損傷區(qū)域神經(jīng)組織生化代謝的紊亂和神經(jīng)遞質(zhì)的變化以及腦組織的修復(fù)有著極大的關(guān)系[3]。

圖4 重疊基因及其對(duì)應(yīng)miRNAFig.4 Overlapping genes and corresponding miRNA

3.2 miRNA參與調(diào)控TBI后的細(xì)胞凋亡

在上述論述中，可發(fā)現(xiàn)顱腦損傷后引起神經(jīng)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和水腫，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡，加重創(chuàng)傷性腦損傷的程度。研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷性腦損傷后大鼠大腦皮質(zhì)中上調(diào)的miRNA有miRNA-23a、miRNA-27a; 有些促凋亡蛋白因子也上調(diào)，如noxa、puma、Bax, BH3-only等因子，這說(shuō)明miRNA-23a、miRNA-27a 等miRNA對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷后的細(xì)胞凋亡起調(diào)控作用，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)起著負(fù)向調(diào)控的作用[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子CXCL13高表達(dá)，其對(duì)應(yīng)的miRNA-346卻下調(diào)，導(dǎo)致大量細(xì)胞凋亡。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)傷性腦損傷大鼠神經(jīng)元細(xì)胞模型中miRNA-22表達(dá)下調(diào)，乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)含量增加，蛋白酶caspase3 活性也增強(qiáng)，人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN )以及蛋白激酶B(ProteinKinaseB，AKT)即凋亡基因蛋白水平增加、而且對(duì)抑制凋亡蛋白如Bcl-2和Bcl-w起著負(fù)向調(diào)控的作用，這提示下調(diào)的miRNA-22可能會(huì)通過(guò)參與調(diào)控PTEN/AKT信號(hào)通路，來(lái)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡起促進(jìn)作用[5]。通過(guò)圖4可發(fā)現(xiàn)，Cxcl13、F13al、Serpine1、Melk、Dtl、Rab7b、Rcc2等多種基因高表達(dá)，而靶標(biāo)miRNA-346下調(diào)，猜測(cè)它們共同調(diào)控細(xì)胞的凋亡。通過(guò)上述多項(xiàng)研究，發(fā)現(xiàn)miRNA極大可能參與調(diào)控TBI后的細(xì)胞凋亡。

3.3 miRNA參與調(diào)節(jié)創(chuàng)傷性腦損傷后突觸的可塑性

突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶細(xì)胞的生物學(xué)基礎(chǔ)，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起著重要的作用。越來(lái)越多的研究資料顯示，miRNA參與調(diào)節(jié)創(chuàng)傷性腦損傷后突觸的可塑性。在孫婷怡，劉良等[6]人的研究中發(fā)現(xiàn)作用于大鼠海馬神經(jīng)元樹突棘的miRNA-134在調(diào)控樹突棘的大小中起著負(fù)性調(diào)控作用。miRNA-134通過(guò)抑制LIM 結(jié)構(gòu)域蛋白激酶 1 ( Lim-domain containing protein kinase 1，LIMK1) 的翻譯，在不影響樹突棘的數(shù)量下使其大小受到限制，在突觸傳遞中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用[7]。突觸受到刺激，會(huì)釋放腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子( Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子作用于相應(yīng)的受體之后，阻斷了對(duì)miRNA-134 的抑制作用，增加了樹突棘數(shù)目。Griesbach 等已檢測(cè)到大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后，BDNF 表達(dá)量上調(diào)，由此推測(cè) miRNA-134 可能參與導(dǎo)致創(chuàng)傷性腦損傷后認(rèn)知功能障礙[8]。研究發(fā)現(xiàn)，Sdc4、Chdh、S1pr3、Cd44、Maff等基因高表達(dá)，但對(duì)應(yīng)的miRNA-134-5P下調(diào)，由此推測(cè)這些高表達(dá)的基因抑制miRNA-134-5P表達(dá)，從而導(dǎo)致創(chuàng)傷性腦損傷后認(rèn)知功能障礙。另外，有一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，Rho家族的一種GTP酶激活蛋白p250GAP，可與多種突觸蛋白發(fā)生作用并水解下游底物上的GTP，并激活與底物相關(guān)的信號(hào)通路，最終破壞突觸結(jié)構(gòu)骨架，減小樹突棘的密度及體積[9]。Gu等用強(qiáng)直刺激引誘大鼠海馬區(qū)謝佛側(cè)枝產(chǎn)生長(zhǎng)時(shí)增強(qiáng)效應(yīng)(Long term potentiation,LTP)后發(fā)現(xiàn)miRNA-26a和miRNA-384-5p的水平下降，經(jīng)過(guò)預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miRNA-26a和miRNA-384-5p參與凋控RSK3基因的表達(dá)。在抑制LTP過(guò)程中的RSK3的活性后，發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)的海馬回的場(chǎng)興奮性突觸后電位( Field excitatory postsynaptic potential，fEPSP)顯著增強(qiáng)，因此推斷RSK3在LTP中扮演著重要角色，miRNA-26a和miRNA-384-5p通過(guò)調(diào)控 RSK3參與了調(diào)節(jié)突觸的可塑性[10]。有研究顯示，抑制 miRNA-9-3p的表達(dá)后，與LTP負(fù)相關(guān)的基因Dmd、SAP97表達(dá)升高[11]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA-26a，miRNA-384-5p和miRNA-9-3p可通過(guò)調(diào)節(jié)LTP影響突觸可塑性的發(fā)生發(fā)展。

3.4 控制炎癥反應(yīng)和miRNA成為治療TBI的新靶點(diǎn)

以往研究資料發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷性腦損傷后血腦屏障破壞，同時(shí)大量的炎癥因子炎癥細(xì)胞進(jìn)入腦循壞中導(dǎo)致細(xì)胞壞死，神經(jīng)組織受到破壞，腦組織發(fā)生一些不可逆的損傷，所以如何控制炎癥反應(yīng)的發(fā)展，減少細(xì)胞的損傷與死亡是今后研究創(chuàng)傷性腦損傷的重點(diǎn)。在上述結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)大量的趨化因子和其他炎癥因子過(guò)度表達(dá)，最終導(dǎo)致了炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，因此如何控制炎癥因子及其相關(guān)基因的表達(dá)是今后探索的方向之一。

創(chuàng)傷性腦損傷中針對(duì)炎癥反應(yīng)的治療還有許多不同的手段，所應(yīng)用的藥物絕大部分為抗炎藥物或者免疫抑制劑，比如糖皮質(zhì)激素、非甾體類抗炎藥，他汀類藥物和特定的細(xì)胞因子抑制劑，在不同的創(chuàng)傷性腦損傷動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究中，這些藥物在神經(jīng)保護(hù)方面都發(fā)揮著比較好的作用[12]。在創(chuàng)傷性腦損傷的治療中，黃體酮也是應(yīng)用較多的一種藥物，在進(jìn)行反復(fù)的基礎(chǔ)研究并結(jié)合一些臨床隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)黃體酮在創(chuàng)傷性腦損傷后早期的炎癥反應(yīng)方面有較好的治療作用，可以恢復(fù)患者的神經(jīng)功能[13]。Zheng等在納入了6項(xiàng)大型臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的系統(tǒng)評(píng)價(jià)中卻指出，在創(chuàng)傷性腦損傷6個(gè)月后對(duì)患者的預(yù)后進(jìn)行評(píng)估，并未發(fā)現(xiàn)黃體酮和安慰劑對(duì)照組在死亡率或神經(jīng)功能預(yù)后上有明顯的差異[14]。上述研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用抗炎藥物抑制創(chuàng)傷性腦損傷后的炎癥反應(yīng)并不都具有良好的治療作用。通過(guò)藥物控制炎癥反應(yīng)治療創(chuàng)傷性腦損傷表現(xiàn)出了二重性。

而基于一些miRNA導(dǎo)致創(chuàng)傷性腦損傷后認(rèn)知功能出現(xiàn)障礙的發(fā)現(xiàn)，為今后創(chuàng)傷性腦損傷的治療提供了新的方向。研究資料顯示，Ge等給創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型的腦室內(nèi)輸注miRNA-21 mimics，發(fā)現(xiàn)大鼠腦組織水腫得到不同程度的緩解，病灶面積減少，細(xì)胞凋亡改善等[15]。因此抑制或促進(jìn)某些miRNA的表達(dá)是治療創(chuàng)傷性腦損傷的新靶點(diǎn)。

4 結(jié) 論

1)創(chuàng)傷性腦損傷后，可引起多個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生變化，而這些差異表達(dá)基因在生物學(xué)過(guò)程、分子功能、細(xì)胞學(xué)組分等方面發(fā)揮著重要作用。

2)創(chuàng)傷性腦損傷與炎癥反應(yīng)有密切的關(guān)系，腦損傷后可引起炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，趨化因子和其它炎癥因子的表達(dá)也發(fā)生變化。因此如何控制炎癥因子及其相關(guān)基因的表達(dá)是今后探索的方向之一。

3)創(chuàng)傷性腦損傷后，重合基因和對(duì)應(yīng)的miRNA分別發(fā)生著上調(diào)或是下調(diào)的不同變化，這些基因和miRNA的變化可能是介導(dǎo)創(chuàng)傷性腦損傷后人體各個(gè)功能發(fā)生障礙的關(guān)鍵靶點(diǎn)，比如一些miRNA參與調(diào)節(jié)創(chuàng)傷性腦損傷后突觸的可塑性。因此，對(duì)其深入研究，能夠?yàn)橹委焺?chuàng)傷性腦損傷提供新的診斷和治療依據(jù)。