IgA 腎病患者與膜性腎病患者外周血單核細胞mRNA分析

梁 爽，凡 奎，張 燕，謝楊眉

(四川省三臺縣人民醫院 腎內科，四川 綿陽 621100)

IgA腎病(IgA Nephropathy，IgAN)是最常見的原發性腎小球腎炎，20%～40%的患者在20年內進展為終末期腎病[1]。膜性腎病(Membranous Nephropathy,MN)是腎病綜合征常見的病理類型之一。經腎臟活檢可確切診斷和鑒別IgAN和MN，但腎穿為有創檢查，存在不易操作等因素。因此，了解 IgAN 和MN的疾病發生發展機制以及尋找特異性生物標記物，能為診斷和鑒別提供簡便、可靠的依據補充。

運用傳統的研究方法和數據處理分析方式常遇見高維度、小樣本、變異大、線性等問題, 不易做到簡便的分類和有效的、系統的分析。生物信息學技術通過綜合利用生物學、計算機科學和信息技術等多學科技術、手段，能夠精確高效的運算大量、復雜的生物數據。通過下載IgAN和MN患者外周血單核細胞DNA高通量數據集，分析篩選關鍵基因和途徑，進行基因本體(Gene Ontology，GO)功能、京都基因基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genome，KEGG)和顯著富集基因蛋白質與蛋白質相互作用(Protein-Protein Interaction，PPI)分析等進一步了解差異表達基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)。

1 材料與方法

1.1 GEO數據庫芯片數據下載

進 入NCBI Gene Expression Omnibus(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，下載GSE73953數據集，該數據集包含 15個IgAN樣本和8個MN樣本。下載其矩陣文件 SOFT formatted family file(s).SOFT 以及原始數據 GSE73953_RAW.tar。通過GEO數據庫評價數據原始值分布。

1.2 方法

1.2.1 篩選差異表達基因(DEGs)

R是集統計分析與圖形顯示于一體的一種統計分析軟件。它擁有一套完整的數據處理、計算和制圖軟件系統。其主要功能包括：數據存儲、數組運算、統計分析、統計作圖和程序編寫等。

下載安裝R軟件。加載limma包[2]，對原始數據進行提取和處理，以及差異表達基因的分析(|LogFC|>2,P<0.05)。R軟件采用R/Bioconductor software version 3.5.1版本。

1.2.2 差異表達基因GO和KEGG分析

運用Cytoscape(https://cytoscape.org/),安裝bingo，將篩選出的前96個差異表達基因導入程序，根據GEO中數據研究對象，選擇Homo sapiens。

運用DAVID數據庫(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery, https://david.ncifcrf.gov/)對差異表達基因進行GO富集分析和KEGG通路分析。Corrected P-Value<0.05 記為有統計學意義。

1.2.3 顯著富集差異表達基因PPI分析

STRING(Search Tool for the Rtrieval of Interacting Genes，https://string-db.org/)是已知和預測蛋白質-蛋白質相互作用的數據庫。相互作用包括直接(物理)聯系和間接(功能)聯系。它們來源于計算預測、生物體之間的知識轉移以及來自其他(主要)數據庫的相互作用。

運用STRING在線數據庫，構建蛋白質互作網絡，取combined score≥0.4，下載PPI網絡數據。通過Cytoscape軟件(version 3.6.1)將PPI網絡可視化，并通過MCODE插件聚類構建共表達模塊。最后，通過R軟件計算PPI 網絡中各個節點的連接度。運行后得到蛋白質相互作用關系圖。

2 結果分析

2.1 GEO數據庫芯片數據

數據來自GEO數據庫GSE73953數據集，下載得到15個IgA Nephropathy樣本和8個Membranous Nephropathy樣本。得到矩陣文件SOFT formatted family file(s).SOFT 以及原始數據 GSE73953_RAW.tar。通過GEO數據庫GEO2R評價數據集原始值分布(見圖1)，基本以中間值為中心表明數據具有可比較性。

2.2 差異表達基因(DEGs)

該數據集包含15個IgA Nephropathy樣本和8個Membranous Nephropathy樣本。通過R軟件limma包[2]，根據限定條件：|LogFC|>2,P<0.05，在IgAN患者和MN患者中得到顯著差異表達基因75個，其中73個上調表達基因和2個下調表達基因。由差異表達基因所得熱圖(見圖2a)和火山圖(見圖2b)。

2.3 差異基因GO和KEGG分析

為進一步了解篩選得到IgAN、MN疾病相關的差異表達基因功能和通路，利用 Cytoscape和DAVID在線數據庫對分析得到的差異基因分別進行GO富集分析與KEGG通路分析。

顯著富集差異表達基因GO富集分析的生物學過程(Biological process，BP)(見圖3a)主要包括蛋白質轉運、內溶酶體到溶酶體轉運、趨化因子介導的信號通路作用和鈣介導信號的調控等。細胞學組分(Cellular components，CC)(見圖3b)主要為COPⅡ囊泡、NMDA選擇性谷氨酸受體復合物和高爾基體等。分子生物學功能(Molecular function，MF)(見圖3c)主要有NMDA谷氨酸受體激活、信號傳感器激活和鈣粘蛋白結合參與細胞與細胞的黏附等。

顯著富集差異表達基因KEGG通路分析(見圖3d)顯示具有統計學差異(P<0.05)的上調及下調差異表達基因通路，包括Endocytosis和Hepatitis B的相關信號通路。

圖1 原始數據集值分布Fig.1 Values distribution of original data set

圖2 差異表達基因熱圖和火山圖Fig.2 Heatmap and volcano map of the DEGs

圖3 GO富集分析和KEGG通路分析Fig.3 GO enrichment analysis and KEGG pathway analysis

2.4 顯著富集基因PPI分析

為進一步篩選差異表達基因所編碼的蛋白質之間的相互作用關系，采用STRING工具對差異表達基因蛋白相互作用關系進行梳理，得到蛋白質相互作用關系圖(見圖4)。按照節點數關系篩選得到前10個關鍵基因，包括：EPS15、STAT4、CCL2、SUN2、SEC24C、SEC31A、GOLGB1、F2R,RAB12和PTK2B。

圖4 顯著富集差異表達基因蛋白相互作用關系Fig.4 Protein interaction of significantly enriched DEGs

3 討 論

IgAN目前被認為是世界上最常見的原發性腎小球腎炎之一[1]。MN是腎病綜合征常見的病理類型之一，大部分為特發性膜性腎病(Idiopathic membranous nephropathy,IMN)[3]。MN的主要病理機制為：循環的自體抗體與腎小球內的內源性抗原結合，并在腎小球毛細血管壁中形成免疫復合物的沉積，補體激活對腎小球足細胞(Podocytes)的影響和對細胞屏障的破壞，導致NS表現[4]。

探尋IgAN 和MN的疾病發生發展機制以及尋找特異性生物標記物，以便診斷和鑒別甚至發現新的治療靶點。生物信息學相關技術通過利用生物學、計算機學和信息技術揭示生物數據所蘊含的奧秘[5]。為了尋找可能有助于更好地理解IgAN和MN分子基礎并有助于診斷的活性病變的新標記物，使用外周血單核細胞(PBMCs)進行DNA分析。通過下載IgAN和MN患者外周血單核細胞DNA高通量數據集，通過篩選差異表達基因、基因富集分析及蛋白質相互作用關系分析。

分析發現，在具有明顯表達差異的250個基因中，包括226個上調的差異表達基因和24個下調的差異表達基因。其中75個顯著DEGs，包括73個上調基因，2個下調基因。GO富集分析的生物學過程(BP)主要包括蛋白質轉運、內溶酶體到溶酶體轉運、趨化因子介導的信號通路作用等。細胞學組分(CC)主要為COPⅡ囊泡、NMDA選擇性谷氨酸受體復合物和高爾基體等。分子生物學功能(MF)主要有NMDA谷氨酸受體激活、信號傳感器激活和鈣粘蛋白結合參與細胞與細胞的黏附等。顯著富集差異表達基因KEGG通路分析包括Endocytosis和Hepatitis B的相關信號通路。PPI篩選出EPS15、STAT4、CCL2、SUN2、SEC24C、SEC31A、GOLGB1、F2R,RAB12和PTK2B等關鍵基因。

EPS15為表皮生長因子受體底物基因，參與細胞生長調節[6]。可能參與細胞增殖的控制，有絲分裂信號的調節，特別是EGFR在網格蛋白涂層凹坑(CCPs)的組裝中發揮作用，可能參與IgA介導的免疫反應[7]。STAT4是一種轉錄因子，它在T細胞和單核細胞中轉導IL-12和IL-23的生成，導致單核細胞激活[8]，一些證據顯示，STAT4可能在多種自身免疫性疾病的進展中發揮著關鍵的作用[9]。相關研究利用炎癥相mRNA表達譜顯示，IgAN患者體內外體趨化因子(C-C motif)配體2 (CCL2)表達上調[10]，表明CCL2可能參與IgA腎臟病的發病和進展。細胞學組分(CC)分析發現主要存在COPⅡ囊泡和高爾基體的差異，研究顯示在prechylomicron運輸囊泡(PCTV)與高爾基體對接時，存在COPII蛋白，并且是需要SEC24C參與[11]。F2R基因存在功能多態性，研究顯示其啟動子多態性改變在結節病中的作用，主要導致炎癥的加重[12],IgAN和MN存在炎性改變，F2R對其是否存在具體影響，目前尚無確切研究證據。RAB12在人PMBCs磷酸化中起重要作用，在帕金森疾病表現顯著[13]，而同SUN2、SEC31,GOLGB1和PTK2B在人IgAN和MN中的具體作用和機制有待進一步研究。

4 結論與展望

篩選出核心差異表達基因,特別是EPS15、STAT4、CCL2,SEC24C和F2R，為IgAN和MN的診斷和鑒別提供簡便、可靠的依據補充，甚至提供治療的新靶點。研究和掌握IgAN和MN疾病特異性的發病機制和特異性標記物，對現階段IgAN和MN的診斷和鑒別具有重要意義。探討基因表達及調控，挖掘特異性蛋白質表達和PPI，有助于尋找新治療靶點。