miR-365對乳頭狀甲狀腺癌TPC-1細胞增殖和侵襲的抑制作用

靳彤 白曉雪 崔現

(1吉林省腫瘤醫院甲狀腺微創外科，吉林 長春 130000；吉林大學第一醫院 2干部病房;3延邊大學附屬醫院腫瘤科)

甲狀腺癌是內分泌惡性腫瘤中最常見的類型，近年來發病率逐漸上升。在甲狀腺癌中，乳頭狀甲狀腺癌約占80%。盡管乳頭狀甲狀腺癌患者的5年生存率超過95%，但其容易發生轉移，可以擴散到淋巴結或遠處的組織中〔1〕。乳頭狀甲狀腺癌的常規治療有激素治療、外科手術及放射性碘消融治療，但這些方法對轉移性病灶無效。因此，迫切需要尋找新型的治療藥物或者藥物靶點。微小RNA(miR)是一類內源性的小RNA分子，在人類疾病中起到了重要的調控作用〔2〕。既往研究顯示，miR-365在乳頭狀甲狀腺癌中表達低于正常組織〔3〕，但其在乳頭狀甲狀腺癌生物學功能方面的作用尚未清楚。本研究探討miR-365在體外對乳頭狀甲狀腺癌細胞系TPC-1細胞的增殖、轉移和侵襲性的影響。

1 材料與方法

1.1實驗細胞 人的正常甲狀腺細胞系NTHY-ORI 3-1細胞和人乳頭狀甲狀腺癌細胞系TPC-1細胞購買自ATCC公司，培養基為10%胎牛血清的 DMEM 完全培養基，培養于37℃含5%CO2的培養箱中，每3天傳代或換液1次。

1.2主要試劑和儀器 高糖DMEM培養基購自Hyclone公司，胎牛血清(FBS)購自BI公司，CCK-8試劑購自碧云天科技有限公司，逆轉錄試劑盒和SYBR Green PCR預混液購自于莫納公司。TRIzol購自Invitrogen公司，miR-365 mimic和miR-365抑制劑(inhibitor)及兩者的陰性對照mimic control和inhibitor control均購自廣州銳博。

1.3實驗方法

1.3.1實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 棄去細胞培養基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗后根據細胞量加入TRIzol，三氯甲烷抽提，異丙醇沉淀后提取細胞總RNA，cDNA的合成為20 ng總RNA逆轉錄。SYBR Green qPCR Supermix與2.5 μl cDNA、1 μl miR-365特異性引物混合后在伯樂實時定量PCR儀中進行測定。以U6為內參，采用2-△△CT值的方式定量細胞中miR-365的表達。

1.3.2細胞活性檢測 消化TPC-1細胞后，培養基重懸制成單細胞懸液。然后將細胞種植于96孔板中，每孔2 000個細胞。待第二天每孔加20 μl CCK溶液，細胞繼續培養1～4 h。將細胞培養板放入酶標儀，設定波長在450 nm處檢測孔中的光學密度(OD)值。

1.3.3細胞劃痕試驗 消化TPC-1細胞后，培養基重懸制成單細胞懸液。然后將細胞種植于6孔板中，每孔1×106個。待第二天細胞長滿后，用200 μl移液頭垂直于細胞培養板底，劃一條直線。用1倍PBS清洗細胞培養板，洗去劃下來的細胞。然后加入無FBS的培養基，將細胞放入37℃、5%CO2培養箱中培養。培養時間為0 h、24 h和48 h，倒置顯微鏡下拍照。愈合率的計算公式為，細胞劃痕的初始寬度減去劃痕的目前寬度然后除以劃痕的初始寬度，得出的小數換算成百分比。

1.3.4Transwell實驗 在Chamber上室底部中央垂直加入100 μl 溶解的基底膜基質，37℃溫育4～5 h使其干成膠狀，將TPC-1細胞轉染后用無血清培養基重懸制成單細胞懸液。下室加入600～800 μl 含不同濃度血清的培養基，上室加入100～150 μl 細胞懸液，培養24 h后用800 μl 甲醇固定，800 μl 結晶紫染色，輕輕用清水沖洗數次，用用棉棒小心擦拭Transwell室底部膜表面，去除膜上的TPC-1細胞。用鑷子取下室底膜。在陰涼避光處晾干后，放置在載玻片上，通過中性樹膠封片，在正置顯微鏡下對膜上的細胞進行拍照并隨機取6個視野計數細胞。

1.4統計學方法 采用GraphPad Prism7.0軟件進行方差分析及q檢驗。

2 結 果

2.1miR-365在TPC-1細胞中的表達 TPC-1細胞株中miR-365水平(0.37±0.06)明顯低于NTHY-ORI 3-1細胞(1.00±0.22，P<0.01)。

2.2miR-365對TPC-1細胞增殖能力的影響 與空白組和對照組比較，miR-365 mimic可明顯降低TPC-1細胞的增殖率(P<0.01)。相反，miR-365 inhibitor可明顯增加TPC-1細胞的增殖率(P<0.01)，miR-365可以調節TPC-1細胞的增殖能力，見表1。

2.3miR-365對TPC-1細胞遷移的影響 miR-365轉染后24 h的TPC-1細胞的遷移能力下降，表現為miR-365 mimic組的劃痕修復率明顯低于空白組與對照組(P<0.01)。然而，轉染miR-365 inhibitor后，TPC-1細胞的遷移能力提高，表現為miR-365 mimic組的劃痕修復率明顯高于空白組與對照組(P<0.05)，miR-365能顯著抑制TPC-1細胞的體外遷移能力。見表1。

2.4miR-365對TPC-1細胞體外侵襲能力的影響 miR-365轉染后24 h的TPC-1細胞的侵襲能力下降與后，表現為miR-365mimic組的小室膜下的細胞數目明顯低于對照組(P<0.01)。然而，轉染miR-365 inhibitor后，TPC-1細胞的侵襲能力提高，表現為miR-365 mimic組的小室膜下的細胞數目明顯高于對照組(P<0.01)，miR-365能顯著抑制TPC-1細胞的體外侵襲能力。見表1。

表1 miR-365 對TPC-1 細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響

3 討 論

miR是長約22個核苷酸的小RNA分子，通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(UTR)結合負調節基因表達，從而抑制或破壞轉錄本翻譯〔4〕。 研究表明miR參與許多不同的生理和病理過程，如細胞增殖、細胞周期、分化及凋亡〔5〕。據報道，miR在腫瘤的發生、發展和進展中發揮著重要的作用，并且在各種癌癥中起著腫瘤抑制劑或致癌基因的作用〔6,7〕。既往研究發現一系列致癌和抑制腫瘤的miR，參與人類乳頭狀甲狀腺癌的發生和發展，這表明miR可以作為乳頭狀甲狀腺癌的診斷標志物和治療藥物〔8～10〕。miR-365位于染色體區域16p13.12。miR-365在各種癌癥類型中的表達是不同的。miR-365在皮膚鱗狀細胞癌中高表達〔11〕。但有報道miR-365在乳頭狀甲狀腺癌組織中呈低表達〔3〕。本研究結果與以往的研究結論一致，提示miR-365可能對乳頭狀甲狀腺癌的增殖、抗凋亡及轉移等生物學行為有著重要的調控作用。已發現miR-365在肝癌中低表達，并通過直接靶向抗凋亡蛋白Bcl2發揮誘導肝癌細胞凋亡的作用〔12〕。另外，發現結腸癌中miR-365水平降低，并且miR-365表達的恢復抑制了細胞周期進程，促進了5-氟尿嘧啶誘導的結腸癌細胞系中細胞凋亡和抑制腫瘤生長〔13〕。然而，miR-365在調控乳頭狀甲狀腺癌細胞生長和轉移過程中的作用尚不清楚。本研究結果表明miR-365對TPC-1細胞體外增殖、遷移和侵襲能力具有明顯的抑制效應。綜上，本研究表明，miR-365在乳頭狀甲狀腺癌細胞中表達下調，體外過表達可明顯抑制TPC-1細胞體外增殖、遷移和侵襲能力。miR-365有望為設計乳頭狀甲狀腺癌的新型治療藥物提供理論依據，為乳頭狀甲狀腺癌的診斷和治療提供新的見解。