LncRNA MCM3AP-AS1靶向調控miR-16-5p表達對肺癌細胞增殖、遷移侵襲的影響及機制

趙天增 黃國勝 楊金華 徐萌博 郭彥偉

(1南陽醫學高等?？茖W校第一附屬醫院普胸外科，河南 南陽 473000；2鄭州大學第五附屬醫院腫瘤內科)

肺癌是世界上最常見的癌癥，也是癌癥死亡的主要原因〔1〕，肺癌的轉移性給疾病的治療帶來很大的困難，分子靶向治療和精準治療已是肺癌治療的主要趨勢〔2〕。研究肺癌的分子機制，為其治療提供更有效的分子靶點是肺癌研究的熱點。LncRNA和miRNA在肺癌組織和細胞系中異常表達，研究表明LncRNA與肺癌的發生、發展和轉移等密切相關，miRNA與肺癌的發生、發展、診斷、預后及耐藥性等有關〔3,4〕。有報道顯示，LncRNA MCM3AP-AS1在膠質瘤內皮細胞〔5〕和肝細胞癌〔6〕中表達上調，干擾或沉默其表達可抑制膠質瘤細胞增殖和侵襲，抑制肝細胞癌細胞的增殖、克隆形成并誘導細胞凋亡。在乳頭狀甲狀腺癌中，MCM3AP-AS1表達上調并促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲〔7〕。miR-16在肺腺癌細胞中低表達，抑制肺腺癌細胞增殖并促進細胞早期凋亡〔8〕。但MCM3AP-AS1在肺癌細胞中的表達及其對肺癌的影響，且其與miR-16-5p在肺癌中的關系目前還尚不清楚。本研究探討LncRNA MCM3AP-AS1對肺癌增殖、遷移和侵襲的影響及miR-16-5p在此影響中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 人肺癌細胞株A549、SPC-A1和NCI-H460及人正常肺上皮細胞BEAS-2B購自ATCC；四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)和胰蛋白酶購自美國Sigma-Aldrich公司；Transwell板購自美國Corning公司；引物、MCM3AP-AS1抑制物(si-MCM3AP-AS1)和過表達載體(pcDNA-MCM3AP-AS1)、miR-16-5p模擬物(miR-16-5p)和抑制物(anti-miR-16-5p)、空載體pcDNA和相應陰性對照、雙熒光素酶載體購自上海吉瑪制藥有限公司；兔源CyclinD1、p21、p27、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、GAPDH抗體均購自上海碧云天生物技術有限公司，兔源MMP-9、MMP-14抗體購自英國Abcam公司；實時熒光定量(qRT)聚合酶鏈式反應(PCR)試劑盒、購自美國Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將肺癌細胞SPC-A1、A549和NCI-H460培養于RPMI-1640培養液中，人正常肺上皮細胞BEAS-2B培養在高糖DMEM培養液中，兩種培養液中均添加10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素，培養條件：飽和濕度，37 ℃ 5%CO2培養箱中培養。傳代保存。

1.2.2細胞轉染 將對數生長期A549細胞稀釋為1×106個/ml接種6孔板培養，融合度達到90%時根據轉染說明書進行瞬時轉染，用無血清OptiMEM培養液分別稀釋Lipofectamine2000或不同載體(片段)，將二者輕柔混勻，室溫下孵育20 min后加入培養好的細胞中，培養6 h后換成RPMI1640完全培養基，收集轉染48 h細胞，檢測轉染效果，進行后續實驗。根據轉染載體(片段)不同實驗分組如下：si-NC組(轉染si-NC)、si-MCM3AP-AS1組(轉染si-MCM3AP-AS1)、miR-NC組(轉染miR-NC)、miR-16-5p組(轉染miR-16-5p mimics)、si-MCM3AP-AS1+anti-miR-NC組(共轉染si-MCM3AP-AS1與anti-miR-NC)、si-MCM3AP-AS1+anti-miR-16-5p組(共轉染si-MCM3AP-AS1與anti-miR-16-5p)。

1.2.3qRT-PCR檢測RNA的表達 TRIzol試劑提取總RNA，根據反轉錄試劑盒步驟合成cDNA，置于于-80℃冰箱保存。按照說明書以取cDNA為模板進行反應，合成MCM3AP-AS1和miR-16-5p，運用2-ΔΔCt方法進行數據分析。

1.2.4MTT實驗測定細胞活性 收集轉染的A549細胞，消化細胞，離心后用培養基重懸細胞，稀釋濃度為1×104個/ml，200 μl/孔接種于96孔板，在培養24 h、48 h和72 h時按照20 μl/孔加入MTT(5 mg/ml)試劑。孵育4 h后棄上清培養基，按照150 μl/孔加入DMSO，震蕩10 min結晶溶解后酶標儀檢測490 nm處的吸光度(A)值。

1.2.5Western印跡實驗 室溫下用RIPA裂解液裂解各組細胞20 min，超聲破碎細胞，獲得蛋白并檢測濃度。進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，轉膜，室溫封閉膜2 h，加入CyclinD1抗體(1∶1 500)、p21抗體(1∶800)、p27抗體(1∶1 500)、MMP-2抗體(1∶1 000)、MMP-9抗體(1∶1 000)、MMP-14抗體(1∶3 000)和抗GAPDH抗體(1∶1 200)一抗，4℃過夜，洗膜3次，然后加入稀釋的二抗，室溫孵育2 h，顯影。以GAPDH為內參照分析蛋白水平。

1.2.6Transwell實驗測定細胞遷移和侵襲 遷移實驗：用無血清RPMI1640培養基調整細胞密度為1×105個/ml。Transwell下層培養孔加入500 μl含10%胎牛血清培養基作為遷移趨化物，Transwell上層小室加入100 μl細胞懸液，將上層小室置于24孔板中，培養24～48 h，棄去上層小室中的培養液，用棉簽拭去上層小室膜表面細胞，甲醛固定下室膜表面細胞后結晶紫染色，顯微鏡觀察計數。

侵襲實驗：采用包被Matrigel基質膠的小室，使用前加入無血清培養液孵育2 h水化后備用。其余步驟同遷移實驗。

1.2.7雙熒光素酶報告系統實驗 按照1.2.2的要求進行細胞培養，培養至細胞融合度為90%時，進行轉染，將構建的MCM3AP-AS1野生型(WT-MCM3AP-AS1)和突變型(MUT-MCM3AP-AS1)雙熒光素酶報告載體分別與miR-NC或miR-16-5p共轉染融合度為90%的A549細胞，轉染后培養48 h，收集細胞，室溫RIPA緩沖液裂解20 min，離心收集裂解后的上清，加入熒光素酶底物，以海腎熒光素酶活性為內參照，用發光儀檢測并計算相對螢火蟲熒光素酶活性。同時將pcDNA、pcDNA-MCM3AP-AS1、si-NC、si-MCM3AP-AS1分別轉染A549細胞，依次記為pcDNA組、pcDNA-MCM3AP-AS1組、si-NC組、si-MCM3AP-AS1組。qRT-PCR方法檢測轉染48 h后細胞中miR-16-5p表達水平。

1.3統計學處理 采用 SPSS19.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1肺癌細胞和正常肺上皮細胞中LncRNA MCM3AP-AS1和miR-16-5p的表達情況 與BEAS-2B組相比，肺癌細胞系A549、SPC-A1和NCI-H460中MCM3AP-AS1表達量均顯著升高(P<0.05)，miR-16-5p表達量顯著下降(P<0.05)，見表1。兩者在3種肺癌細胞系中的表達趨勢一致，選擇表達差異相對較大的A549細胞進行后續實驗。

表1 LncRNA MCM3AP-AS1和miR-16-5p在肺癌細胞和正常肺上皮細胞中的表達

2.2抑制MCM3AP-AS1表達對肺癌A549細胞增殖的影響 si-MCM3AP-AS1組A549細胞中MCM3AP-AS1表達量、細胞活性(48 h、72 h)、增殖蛋白CyclinD1表達顯著低于si-NC組(P<0.05)，增殖負調節蛋白p21和p27表達顯著高于si-NC組(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 抑制MCM3AP-AS1表達對肺癌A549細胞增殖相關蛋白表達的影響

表2 抑制MCM3AP-AS1表達對肺癌A549細胞增殖的影響

2.3抑制MCM3AP-AS1表達對肺癌A549細胞遷移、侵襲的影響 與si-NC組相比，si-MCM3AP-AS1組遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著下降(P<0.05)，遷移和侵襲蛋白MMP-2、MMP-9和MMP-14均顯著降低(P<0.05)，見圖2，圖3,表3。

圖2 抑制MCM3AP-AS1表達對肺癌A549細胞遷移、侵襲蛋白表達的影響

圖3 抑制MCM3AP-AS1表達對肺癌A549細胞遷移、侵襲的影響(結晶紫染色，×200)

表3 抑制MCM3AP-AS1表達對肺癌A549細胞遷移、侵襲的影響

2.4過表達miR-16-5p對肺癌A549細胞增殖、遷移、侵襲的影響 miR-16-5p組的miR-16-5p表達量顯著高于與miR-NC組(P<0.05)，A549細胞活性(48 h、72 h)、增殖相關蛋白CyclinD1表達、遷移細胞數和侵襲細胞數、侵襲蛋白MMP-2和MMP-9表達均顯著低于miR-NC組(P<0.05)，p21表達表達高于miR-NC組(P<0.05)，見表4，圖4。

2.5MCM3AP-AS1靶向調控miR-16-5p的表達 MCM3AP-AS1與miR-16-5p之間存在互補的核苷酸序列，見圖5。與轉染miR-NC相比，轉染miR-16-5p mimics顯著降低WT-MCM3AP-AS1相對熒光素酶活性(P<0.05)；與轉染miR-NC相比，轉染miR-16-5p mimics對MUT-MCM3AP-AS1相對熒光素酶活性無顯著影響。見表5。與pcDNA組miR-16-5p表達量(1.02±0.09)相比，pcDNA-MCM3AP-AS1組(0.37±0.04)顯著下降(P<0.05)；與si-NC組miR-16-5p表達量(0.98±0.08)相比，si-MCM3AP-AS1組(2.75±0.28)顯著上升(P<0.05)，說明MCM3AP-AS1靶向負向調控miR-16-5p的表達。

表4 miR-16-5p過表達對肺癌A549細胞增殖、遷移、侵襲的影響

圖4 miR-16-5p過表達對肺癌A549細胞增殖、遷移、侵襲相關蛋白的影響

圖5 MCM3AP-AS1與miR-16-5p靶向結合

表5 雙熒光素酶報告實驗

2.6抑制miR-16-5p表達減弱MCM3AP-AS1抑制對A549細胞增殖、遷移、侵襲的影響 si-MCM3AP-AS1組miR-16-5p表達量顯著高于si-NC組(P<0.05)，細胞活性(48 h和72 h時)、增殖相關蛋白CyclinD1表達、遷移和侵襲細胞數、侵襲蛋白MMP-2和MMP-9表達均顯著低于si-NC組(P<0.05)，p21蛋白表達高于si-NC組(P<0.05)；與si-MCM3AP-AS1+anti-miR-NC組相比，si-MCM3AP-AS1+anti-miR-16-5p組miR-16-5p表達量顯著低于si-MCM3AP-AS1+anti-miR-NC組(P<0.05)，細胞活性(48 h和72 h時)、增殖相關蛋白CyclinD1表達、遷移和侵襲細胞數、侵襲蛋白MMP-2和MMP-9表達均顯著高于si-MCM3AP-AS1+anti-miR-NC組(P<0.05)p21蛋白表達高于si-MCM3AP-AS1+ anti-miR-NC組(P<0.05)。見圖6，表7。

1～4：si-NC組、si-MCM3AP-AS1組、si-MCM3AP-AS1+anti-miR-NC組、si-MCM3AP-AS1+anti-miR-16-5p組

表7 抑制miR-16-5p表達逆轉了下調MCM3AP-AS1表達對A549細胞增殖、遷移、侵襲的作用

3 討 論

吸煙是肺癌的主要原因，預計2035年全球約有300萬人因肺癌死亡〔9〕，而肺癌患者確診時多為晚期，患者預后和生存質量較差。2014年，英國國家統計局報告稱，診斷為遠處轉移性肺癌(Ⅳ期)的患者1年生存率僅為15%～19%〔10〕。因此研究肺癌的早期分子診斷和晚期治療靶點也是肺癌臨床所急需的。

LncRNA和miRNA調控肺癌的發生和發展，對肺癌的臨床診斷、治療和預后起重要作用〔11,12〕。研究表明，LncRNA MCM3AP-AS1在乳腺癌中表達上調，受雌激素正向調控，并與患者的無復發生存率較差有關〔13〕。MCM3AP-AS1在彌漫性膠質瘤樣本中隨著腫瘤分級的升高表達下調，與患者預后及惡性進展有顯著相關性〔14〕。Zhu等〔15〕在對肺腺癌的LncRNA生物標志物的研究中發現MCM3AP-AS1在肺腺癌中與LINC00649存在競爭關系，具體的作用機制未有闡述。本研究結果說明MCM3AP-AS1在肺癌發展中具有重要作用。MCM3AP-AS1與miR-16-5p之間存在互補的核苷酸序列，提示miR-16-5p可能參與MCM3AP-AS1對肺癌發展和轉移的調控過程。已有研究顯示脊索瘤〔16〕和乳腺癌〔17〕中miR-16-5p表達下調，過表達miR-16-5p顯著抑制脊索瘤和乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，并誘導乳腺癌細胞凋亡。Fan等〔18〕也發現miR-16-5p非小細胞肺癌(NSCLC)患者血清中表達顯著下調，其與miR-15b-5p和miR-20a-5p聯合可能是NSCLC的診斷標志物。Liu等〔19〕最新結果表明，miR-16-5p在脂多糖(LPS)誘導的肺癌A549細胞損傷中表達下調，其通過靶向CXCR3抑制LPS誘導的A549細胞損傷。本研究結果Fan等〔18〕研究結果一致，過表達miR-16-5p可抑制A549細胞增殖、遷移、侵襲，證實了miR-16-5p在肺癌發展中的重要作用。

本研究顯示，miR-16-5p是MCM3AP-AS1的靶基因，過表達或抑制MCM3AP-AS1分別下調或上調miR-16-5p表達水平，抑制miR-16-5p顯著減弱下調MCM3AP-AS1對A549細胞的抗增殖和抗遷移和侵襲作用，這進一步證實了在肺癌中兩者存在調控關系。